عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

الهدف العام من التجربة التالية هو رصد التعبير الجيني العابر لمراسل مُوسوم بـ GFP في خلايا البشرة لورقة التبغ. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصميم بنية DNA يتم التعبير عنها في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسومات. ثم يتم بناء هذه البنية باستخدام تضخيم PCR وتجميع Gibson.

بعد ذلك، يُستخدم مسدس الجينات لإيصال البنية الجينية إلى خلايا البشرة في ورقة التبغ. وفي النهاية، يكشف تصوير ورقة التبغ بواسطة المجهر البؤري عن تعبير GFP في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسومات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الاستنساخ التقليدي، في أنها لا تتطلب إنزيمات القطع، وبالتالي يمكن استنساخ أي تسلسل يمكن تضخيمه بواسطة PCR.

نظراً للمرونة التي يتميز بها التصميم الجيني، تمتد تطبيقات هذه التقنيات إلى نطاق أوسع. الهندسة الوراثية للنباتات الزراعية: ابدأ هذا البروتوكول بتحديد المواقع داخل الخلية النباتية للتعبير البروتيني النهائي. والهدف من هذا العمل هو توجيه التعبير إلى البلاستيدة الخضراء، والبيروكسيسوم، والسيتوسول.

بعد ذلك، قم بتصميم بنية التعبير (expression construct). يجب أن تحتوي البنية على محفز (promoter)، وجين قابل للكشف، ومنهي (terminator) ضمن بلازميد واحد. في هذه الحالة، يقوم المحفز التأسيسي P end cup two بتوجيه التعبير عن GFP، والذي يليه منهي Nolene Synthe أو nos t.

لاحظ أنه في هذه التجربة، سنقوم باختبار سلسلة من العلامات، وهي علامات trit، واحدة واثنتان وثلاث، يتم التعبير عنها في الطرف النهائي لـ GFP للتعبير في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسومات. تعتمد طريقة تجميع جيبسون (Gibson assembly) على عمل عدة إنزيمات في مزيج جاهز لهضم أطراف الحمض النووي DNA مزدوج السلسلة جزئياً وتسهيل تلدين أزواج القواعد المتكاملة لتسلسلات DNA المتجاورة. يتكون البناء النهائي من ثلاثة أجزاء يجب تضخيمها في أربعة تفاعلات PCR قبل تجميع جيبسون.

تقوم التفاعلان الأول والثاني بتضخيم ناقل بلازميدي بطول 8, 000 زوج قاعدي، PORE، والذي يحتوي على GFP NOS T، وعلامة مقاومة cany. وتُعد علامة المقاومة نقطة مناسبة لتقسيم هذا الحمض النووي الكبير إلى قالبين أصغر يسهل تضخيمهما بواسطة تقنية PCR. ويقوم التفاعل الثالث بتضخيم المحفز P end cup two، بينما يقوم التفاعل الرابع بتضخيم triag one باستخدام برنامج تصميم حاسوبي (in silico) مثل ape design، حيث تم تصميم البنية قاعدة بقاعدة بحيث يكون هناك تداخل بطول 50 زوج قاعدي بين كل قطعة.

عند طلب البادئات لتفاعل PCR، يمكن استخدام التداخل المكون من 50 زوجاً قاعدياً بحيث تكون البادئات مكونة من 25 زوجاً قاعدياً في كل اتجاه. بعد إجراء تفاعل PCR لتضخيم كل مكون، يتم تنقية ناتج PCR بشكل منفصل وتخفيفه في ماء مقطر منزوع الأيونات. إذا كان قالب PCR عبارة عن تحضير مصغر (mini prep) من بكتيريا e coli، فإن المعالجة بإنزيم القطع DPN ستعمل على إزالة الحمض النووي القالب الملوث. بعد ذلك، يتم قياس تركيزات كل قطعة من قطع DNA.

قم بضبط تركيز الناقل إلى 150 nanograms per microliter تقريباً لكل بنية سيتم تجميعها، بما في ذلك عينة ضابطة، ثم خذ مقدار 15 microliter من خليط Gibson Assembly من المجمد وأذبه على الثلج. وباستخدام الأداة مفتوحة المصدر عبر الإنترنت @gibbon. org، حدد الأحجام المطلوبة للحصول على كميات متساوية المولات من كل قطعة من القطع.

أضف الحجم المحسوب من كل قطعة من القطع إلى 15 µL من مزيج Gibson. قم أيضاً بتحضير عينة ضابطة من DNA الناقل وحده. يجب أن يكون الحجم الإجمالي لكل تفاعل 20 µL.

استخدم الماء لضبط الحجم إذا لزم الأمر. حضّن الأنابيب عند درجة حرارة 50 إلى 55 °C لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. وبعد انتهاء فترة التحضين، ضع الأنابيب مرة أخرى على الثلج.

أخرج أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على تحضير تجاري من 200 µL من بكتيريا e coli المختصة بكالسيوم كلوريد من مجمد بدرجة حرارة -80 °C، وقم بتدفئته قليلاً باليد. بعد ذلك، أضف كامل الـ 20 µL من التفاعل إلى بكتيريا e coli. حضن المزارع على الثلج لمدة 30 دقيقة، ثم انقلها إلى حمام مائي عند 42 °C وقم بإجراء صدمة حرارية لمدة 60 ثانية.

لا تستخدم الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية (electro competent cells). فقد يؤدي التركيز العالي نسبياً للأملاح والتركيز المنخفض للحمض النووي DNA إلى حدوث قوس كهربائي في الخلايا. بعد عملية التحول، أعد المزارع إلى الثلج لمدة دقيقتين، ثم أضف 750 µL من وسط SOC أو LB واتركها لتتعافى لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

في اللوحة التالية، يتم تحضين الخليط على أطباق LB تحتوي على cany أو أي مضاد حيوي مناسب آخر عند 37 درجة مئوية طوال الليل، ثم يتم فحص 10 مستعمرات عن طريق التسلسل. يرجى ملاحظة أن هذه الطريقة قد تؤدي إلى خلفية أعلى وعدد أكبر من أحداث إعادة التركيب غير المستهدفة مقارنة بالاستنساخ التقليدي القائم على الربط. وقد سبق وصف عملية التحول الحيوي للتبغ باستخدام مسدس الجينات في JoVE.

تتم هنا مراجعة الخطوات والاختلافات الرئيسية عن البروتوكولات السابقة. بعد تضخيم وعزل البنى الجينية، يتم تحضير قذائف مسدس الجينات كما هو موضح في مقال JoVE الذي أعده woods و zeto، ثم تُحمل في مسدس الجينات لإجراء عملية تعداء الأنسجة البشرية لورقة تبغ من نوع Nico Tania Benham Miana. اختر ورقة كبيرة قريبة من قاعدة نبات يتراوح عمره بين ثلاثة إلى خمسة أشهر.

ضع الورقة بعناية بحيث يكون الجانب السفلي للأعلى على مناشف ورقية مبللة في طبق بتري بقطر 15 سنتيمتر، مع ارتداء واقيات العين والأذن المناسبة. اضبط ضغط الهيليوم في مسدس الجينات على 200 إلى 250 PS.I، ثم وجه مسدس الجينات بعناية بين العروق في الجانب السفلي من الورقة، على ارتفاع يتراوح من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات تقريبًا فوقها. حرر صمام الأمان وقم بإيصال الجسيمات إلى الورقة.

استخدم كل رصاصة مرتين في نفس الموقع على الورقة. انتقل إلى موقع آخر وكرر العملية إذا انفجرت الورقة، ثم تخلص منها وابدأ بورقة جديدة. هناك بعض التباين في صلابة الورقة بسبب ظروف النمو مثل العمر والرطوبة وما إلى ذلك.

بعد إتمام جميع عمليات الحقن، قم بتغطية الورقة وتخزينها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في إضاءة منخفضة على طاولة المختبر. افحص الورقة باستخدام مجهر تشريحي مجهز بفلورسنت UV وابحث عن الخلايا الفردية التي تعبر عن GFP. عند العثور على خلايا تعبر عن GFP، استخدم مقص تشريح لاستئصال مقاطع من الورقة بطول يتراوح من 5 إلى 10 مليمتر بعناية.

اغمر فوراً كل قطعة من أوراق الشجر في بئر شريحة مجهرية عميقة تحتوي على حوالي 200 µL من Triton X 100 بتركيز 0.1%. يساعد المنظف في منع تكون فقاعات الهواء على السطح، وتسمح الشريحة المجهرية ذات البئر العميق بتصوير مساحة أكبر من الأنسجة؛ قم بتصوير الخلايا باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) مجهز بالمرشحات المناسبة وعدسة شيئية غمر مائي 40 x. في هذه الدراسة، تمت مقارنة ثلاثة تركيبات مختلفة من GFP الموجهة للعضيات مع GFP غير المسمى و rubis.Coag.

استُخدم المجهر البؤري لبروتين GFP للكشف عن فلورة GFP في الخلايا المفردة التي خضعت للتحول المؤقت في تجارب الضبط التي تم فيها التعبير عن GFP غير الموّسم. تُلاحظ الفلورة في النواة والسيتوسول فقط، ولكن ليس في البلاستيدة الخضراء، والتي يتم تحديدها من خلال الفلورة الذاتية الحمراء للكلوروفيل كما هو موضح في هذا المثال لخلية تم ترانسفكشنها بـ Rubis Oag الموجه للبلاستيدة الخضراء فقط. تم التعبير عن بناء GFP GFP في العضيات الكبيرة.

تم تحديد حدود الخلية باللون الأبيض. يشير اللون الأصفر إلى مناطق التوضع المشترك للمركب مع الكلوروفيل، مما يدل على أن المركب يستهدف البلاستيدة الخضراء كما هو موضح في هذه الصورة لخلية واحدة محولة بـ triag one؛ حيث يظهر تعبير GFP في البلاستيدات الخضراء، والمناطق الطرفية، والسيتوسول، وعضيات نقطية صغيرة يُعتقد أنها بيروكسيسومات. وبالمثل، تعبر الخلايا المحولة بـ triag two أيضًا عن GFP في البلاستيدات الخضراء والسيتوسول والبيروكسيسومات. أما triag three، والذي يتكون من إشارة بيروكسيسوم مدمجة داخل منطقة منخفضة التعقيد من تسلسل البلاستيدة الخضراء، فقد تمركز فقط في البلاستيدة الخضراء والبيروكسيسوم.

لاحظ أن هذه الخلية تقع في طبقة ورقية مختلفة. يلخص هذا الشكل التعبير الملاحظ في مقصورات خلية بشرة ورقة تبغ نموذجية. تظهر الأحجام والمواقع النسبية داخل الخلية، بالإضافة إلى مستويات التعبير النسبية التي لوحظت عبر عفن الجين (gene gun transfection) والمجهر البؤري (confocal microscopy).

لاحظ أن GFP غير المسمى يتمركز في العصارة الخلوية والنواة، بينما يتمركز تحكم PIMT two GFP في البلاستيدات الخضراء، ويتمركز كل من triag one GFP وtriag two GFP وTriag 3G FP في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسومات كما كان متوقعاً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء بلازميد باستخدام تجميع جيبسون (Gibson assembly)، ونقله باليستياً إلى أوراق التبغ، ومراقبة تعبير GFP في غضون ثلاثة أيام. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام 150 nanograms per microliter من DNA الناقل لتجميع جيبسون، و1500 nanograms per microliter من بناء DNA النهائي لصنع رصاصات مسدس الجينات. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ترانسفكشن الأجروبكتيريوم (agrobacterium transfection) للحصول على تعبير جيني مستقر بدلاً من التعبير العابر.