عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة التعبير الجيني العابر لمراسل GFP الموسوم به في خلايا بشرة أوراق التبغ. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم بنية الحمض النووي أولا التي سيتم التعبير عنها في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسومات. ثم يتم بناء البناء باستخدام تضخيم PCR وتجميع Gibson.

بعد ذلك ، يتم استخدام مسدس الجينات لتوصيل البناء إلى خلايا بشرة أوراق التبغ. في النهاية ، يكشف تصوير أوراق التبغ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر عن تعبير GFP في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الاستنساخ الكلاسيكي ، هي أنها لا تتطلب إنزيمات تقييد ، وبالتالي ، يمكن استنساخ أي تسلسل يمكن تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل .

بسبب مرونة التصميم الجيني ، تمتد تطبيقات هذه التقنيات إلى نطاق أوسع. الهندسة الوراثية للنباتات الزراعية ابدأ هذا البروتوكول بتحديد المواقع داخل الخلية النباتية للتعبير النهائي عن البروتين. بالنسبة لهذا العمل ، الهدف هو استهداف التعبير عن البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسوم والعزول الخلوي.

بعد ذلك ، صمم بنية التعبير. يجب أن يحتوي البناء على محفز وجين يمكن اكتشافه وفاصل داخل بلازميد واحد. في هذه الحالة ، يقود المحفز التأسيسي P end cup two التعبير عن GFP ، والذي يتبعه Nolene Synthe أو Terminator أو nos t.

لاحظ أنه في هذه التجربة ، سنختبر سلسلة من العلامات ، والعلامات المبتذلة ، وطرف طرف واحد ، واثنين ، وثلاثة معبرا عن GFP للتعبير في البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسومات. تعتمد طريقة تجميع جيبسون على عمل العديد من الإنزيمات في مزيج معد مسبقا لهضم جزئيا نهايات الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل وتسهيل تلدين أزواج القواعد التكميلية لتسلسلات الحمض النووي المجاورة. يتكون البناء النهائي من ثلاثة أجزاء يجب تضخيمها في أربعة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل تجميع جيبسون.

تعمل التفاعلات الأولى والثانية على تضخيم متجه البلازميد المكون من 8،000 زوج أساسي ، المسام ، الذي يحتوي على GFP NOS T ، وعلامة مقاومة كاني. تعد علامة المقاومة مكانا جيدا لتقسيم هذا الحمض النووي الكبير إلى قالبين أصغر يتم تضخيمهما بسهولة أكبر لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يعمل التفاعل الثالث على تضخيم المروج P نهاية الكوب الثاني ، ويقوم التفاعل الرابع بتضخيم triag one باستخدام برنامج تصميم السيليكو مثل تصميم ، وهو قاعدة البناء للقاعدة ، بحيث يكون هناك تداخل 50 زوجا أساسيا بين كل قطعة.

عند طلب بادئات ل PCR ، من الممكن استخدام 50 زوجا أساسيا متداخلا حيث أن البادئات 25 زوجا أساسيا في كل اتجاه بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم كل مكون ، قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل منفصل وتخفيفه في الماء المقطر منزوع الأيونات. إذا كان قالب تفاعل البوليميراز المتسلسل عبارة عن إعداد مصغر من علاج الإشريكية القولونية باستخدام إنزيم التقييد DPN ، إزالة الحمض النووي للقالب الملوث. بعد ذلك ، قم بقياس تركيزات كل قطعة من قطع الحمض النووي.

اضبط تركيز المتجه على حوالي 150 نانوغرام لكل ميكرولتر لكل بنية يتم تجميعها ، بما في ذلك عنصر التحكم ، خذ حصة 15 ميكرولترا من مزيج Gibson Assembly من الفريزر وقم بإذابة الثلج. باستخدام tool@gibbon المصدر المفتوح عبر الإنترنت. org ، حدد أحجام الكميات متساوية المولار لكل جزء من الأجزاء.

أضف الحجم المحسوب لكل جزء من الأجزاء إلى مزيج جيبسون سعة 15 ميكرولترا. قم أيضا بإعداد التحكم في الحمض النووي الناقل وحده. يجب أن يكون الحجم الإجمالي لكل تفاعل 20 ميكرولترا.

استخدم الماء لضبط مستوى الصوت إذا لزم الأمر. احتضان الأنابيب عند 50 إلى 55 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد.

قم بإزالة أنبوب fuge صغير يحتوي على مستحضر تجاري من 200 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المختص ب e coli من فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وقم بتسخينه قليلا باليد. ثم أضف كل 20 ميكرولترا من التفاعل إلى الإشريكية القولونية. احتضن المزارع على الجليد لمدة 30 دقيقة ، ثم انقلها إلى حمام مائي عند 42 درجة مئوية وصدمة حرارية لمدة 60 ثانية.

لا تستخدم الخلايا المختصة بالكهرباء. قد يتسبب تركيز الملح المرتفع نسبيا وتركيز الحمض النووي المنخفض في قوس الخلايا بعد التحول. أعد المزارع إلى ICE لمدة دقيقتين ، ثم ضع 750 ميكرولتر من SOC أو LB المتوسطة واتركها تتعافى لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

الطبق التالي ، يحتضن الخليط الموجود على ألواح LB مع الكاني أو أي مضاد حيوي مناسب آخر عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها 10 مستعمرات عن طريق التسلسل. لاحظ أن هذه الطريقة قد تؤدي إلى خلفية أعلى وعدد أكبر من أحداث إعادة التركيب غير المستهدفة من الاستنساخ التقليدي القائم على الربط. تم وصف النقل الحيوي للتبغ بمسدس جيني سابقا في JoVE.

هنا ، تتم مراجعة الخطوات والاختلافات الرئيسية عن البروتوكولات السابقة. بعد تضخيم وعزل التركيبات ، قم بإعداد رصاصات بندقية الجينات كما هو موضح في مقالة JoVE بواسطة Woods و zeto وتحميلها في مسدس الجينات لتعداء أنسجة بشرة أوراق التبغ Nico Tania Benham Miana. اختر ورقة كبيرة قريبة من قاعدة نبات عمره ثلاثة إلى خمسة أشهر.

ضعه بعناية من أسفل لأعلى على مناشف ورقية مبللة في طبق بتري بطول 15 سم مع ارتداء الحماية المناسبة للعين والأذن. اضبط ضغط الهيليوم لمسدس الجينات على 200 إلى 250 حصانا. أقوم بتوجيه مسدس الجينات بعناية بين الأضلاع على الجانب السفلي من الورقة ، على ارتفاع حوالي ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات فوقها. حرر السلامة وتوصيل الجسيمات إلى الورقة.

استخدم كل رصاصة مرتين في نفس المكان على الورقة. انتقل إلى مكان آخر وكرر العملية إذا انفجرت الورقة ، وتخلص منها وابدأ ورقة جديدة. هناك بعض التباين في صلابة الأوراق بسبب ظروف النمو مثل العمر والرطوبة وما إلى ذلك.

بعد تسليم جميع اللقطات ، قم بتغطية الورقة وتخزينها من يومين إلى ثلاثة أيام في إضاءة منخفضة على المقعد. افحص الورقة في مجهر تشريح مجهز بالأشعة فوق البنفسجية المضان وابحث عن الخلايا الفردية التي تعبر عن GFP. عندما يتم العثور على الخلايا التي تعبر عن GFP ، استخدم مقص التشريح لاستخراج أقسام من خمسة إلى 10 ملم من الورقة بعناية.

اغمر على الفور كل جزء من الأوراق الفردية في بئر شريحة مجهر بئر عميق تحتوي على حوالي 200 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X 100. يساعد المنظف على منع تكون فقاعات الهواء على السطح وتسمح شريحة مجهر البئر العميق بخلايا صورة منطقة تصوير الأنسجة الأكبر باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بالمرشحات المناسبة وهدف الغمر في الماء 40 ×. في هذه الدراسة ، تمت مقارنة التركيبات الثلاثة المختلفة لاستهداف عضيات GFP بإلغاء علامة GFP و rubis. كواغ.

تم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر GFP للكشف عن مضان GFP في الخلايا المفردة المحولة بشكل عابر في تجارب التحكم التي تم فيها التعبير عن GFP غير الموسوم. لوحظ التألق في النواة والعصارة الخلوية فقط ، ولكن ليس البلاستيدات الخضراء ، والتي يتم تحديدها من خلال التألق الذاتي الأحمر للكلوروفيل كما هو موضح في هذا المثال لخلية منقولة بالبلاستيدات الخضراء فقط روبيس أوغ. تم التعبير عن بناء GFP GFP في العضيات الكبيرة.

الخلية محددة باللون الأبيض. يشير اللون الأصفر إلى مناطق التموضع المشترك للبناء مع الكلوروفيل مما يشير إلى أن البناء يستهدف البلاستيدات الخضراء كما هو موضح في هذه الصورة لخلية واحدة منقولة يظهر تعبير GFP في البلاستيدات الخضراء والمحيطات والعصية الخلوية والعضيات الصغيرة التي يعتقد أنها بيروكسيسوم. وبالمثل ، فإن الخليتين المنقولتين تعبر أيضا عن GFP في العصارة الخلوية للبلاستيدات الخضراء وبيروكسيسومات الثلاث ، والتي تتكون من إشارة بيروكسيسوم مدمجة في منطقة منخفضة التعقيد من تسلسل البلاستيدات الخضراء ، مترجمة فقط إلى البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسوم.

لاحظ أن هذه الخلية في طبقة أوراق مختلفة. يلخص هذا الشكل التعبير الذي لوحظ في مقصورات خلية بشرة أوراق التبغ النموذجية. يتم عرض الأحجام والمواقع النسبية داخل الخلية ومستويات التعبير النسبية التي لوحظت عن طريق تعداء مسدس الجينات والفحص المجهري متحد البؤر.

لاحظ أن untag GFP يتم توطينه إلى العصارة الخلوية والنواة ، وتحكم PIMT اثنين GFP يتم توطينه إلى البلاستيدات الخضراء والثلاثي واحد GFP ، وثلاثي اثنين GFP ، و Triag 3G FP مترجم إلى البلاستيدات الخضراء والبيروكسيسوم كما هو متوقع ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء بلازما باستخدام تجميع جيبسون ، توصيله إلى أوراق التبغ ، ومراقبة تعبير GFP في غضون ثلاثة أيام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام 150 نانوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الناقل لتجميع جيبسون ، و 1500 نانوجرام لكل ميكرولتر من بنية الحمض النووي النهائية لصنع رصاصات بندقية الجينات الخاصة بك باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تعداء البكتيريا الزراعية للحصول على تعبير جيني مستقر بدلا من عابر.