جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

هنا، نحن تصف البروتوكول استنادا إلى إعادة برمجة جينية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) نحو توليد السكان متجانسة من الأسلاف العضلات والهيكل العظمي أنه في ظل ظروف ثقافة متساهلة تشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres)، والتي تلخص السمات البيولوجية البشرية عضلات الهيكل العظمي.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مجالات myos. هياكل تشبه EB تتكون من خلايا عضلية هيكلية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعادة برمجة الخلايا عن طريق العدوى الفيروسية العدسية باف 60 درجة مئوية ، والخطوة الثانية من الإجراء هي إصابة نفس الخلايا بفيروس ثان ، وهو فيروس العدسات العضلية D.

ثم يتم حث الخلايا المصابة على تكوين مجاميع مثل EB لمدة خمسة أيام في وسط مزرعة قائم على المصل. ثم يتم استبدال وسط EB بوسط تمايز خال من المصل ، ويتم زراعة الركام لمدة أسبوعين آخرين في مجالات myos. في النهاية ، يتم استخدام التألق المناعي لتصور أقسام من المجاميع المدمجة في OCT.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التنكس عالي الغلة لخلايا العضلات الهيكلية التي لا يتطلب الاشتقاق على حد سواء من أسلاف اللحمة المتوسطة أو الأديم المتوسط فرزا للحقائق وبالتالي فهو متوافق مع نظام ثقافي ثلاثي الأبعاد في اليوم السابق للإصابة بالخلايا الجذعية الجنينية البشرية في ست صفائح آبار ، أضف استنساخ الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ومكمل التعافي إلى الوسط عند 1000 × للتركيز النهائي لاثنين من الميكرومولار في اليوم التالي يصيب اليوم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بحمام عالي العيار 60 CGFP lentivirus. أولا ، قم بفصل بئر من الخلايا في معلق خلية واحدة عن طريق إضافة مليلتر واحد من الكرشة واحتضان اللوحة لمدة خمس دقائق. ثم اجمع التعليق وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل.

أضف تسعة ملليلتر من الوسط المحضر وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق أثناء انتظار مليلتر من جبل SIR ، واحد. أضف بولي الدماغ بتركيز نهائي ستة ميكروغرام لكل مليلتر ومكملات استعادة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عند اثنين من الضواح.

ثم أعد تعليق الخلايا في هذا المحلول وانقلها إلى بئر واحد من ستة آبار لوحة تعلق منخفضة. الآن أضف الحمام المركز 60 [ك] فيروس في تعدد العدوى من 100 مليون. احتضان اللوحة لمدة ثلاث ساعات مع الفيروس.

ثم اجمع الخلايا وقسمها إلى بئرين من الألواح المطلية ب matrigel. إلى كل طبق ، أضف ملليلترين من mt ، SIR ، واحد مع اثنين من مكمل micromolar ، ثم احتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، استبدل وسائل الإعلام بوسائل الإعلام الجديدة.

سيبدو أن الخلايا قد تجمعت بالفعل بعد 48 ساعة من ظهور العدوى. تحقق من التألق لتقييم كفاءة العدوى. استمر في تغييرات الوسائط اليومية حتى تصل الخلايا إلى 80٪ التقاء ، ثم قم بفصل الخلايا وفيروس myo D عن الخلايا باستخدام نفس البروتوكول.

حافظ على الخلايا المصابة مع تغيرات متوسطة يومية حتى تصل إلى التقاء 80٪ في اليوم السابق لنقطة النمو هذه. لوحة MES على ألواح مطلية ب matrigel عند 1000 خلية لكل سنتيمتر مربع لتمرير الخلايا المصابة إلى لوحة ME'S. في اليوم التالي.

استخدم رحلة ALI لفصلها ونقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر إلى الخلايا. أضف تسعة ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وقم بطردها لأسفل. أضف 1 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

Resus ، قم بتعليق الخلايا المحببة في ستة ملليلتر جديد من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. الآن قم بإزالة الوسط من طبقين من mes وأضف الخلايا المصابة إليهما. احتضان الخلايا لعدة أيام.

مرة واحدة ، أضف 80٪ التقاء. قم بإزالة جميع الوسائط وأضف مليلتر من الكولاجيناز أربعة. أضف ملليغراما واحدا لكل مليلتر بعد خمس دقائق في الكولاجيناز عند 37 درجة مئوية.

استبدل الكولاجيناز بملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. ثم تحت مجهر التشريح ، اكشط المستعمرات باستخدام طرف ماصة سعة 10 مليلتر ، وانقل المستعمرات إلى أنبوب سعة 15 مليلتر واتركها تستقر. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

ثم قم بوضع الخلايا بنسبة واحد إلى أربعة إلى ألواح الميثامفيتامين يجب أن تكون الخلايا المصابة بعدد كبير وأن تكون مستعمرات ذات نوعية جيدة لهذا الإجراء. قم بإزالة الوسائط من كل بئر وأضف ملليلتر واحد من الكولاجيناز. أربعة.

أضف ملليغراما واحدا لكل تركيز مليلتر كما كان من قبل ، وتفاعل الكولاجيناز بعد خمس دقائق عن طريق استبداله بوسط EB. ثم استخدم المجهر بسرعة لكشط المستعمرات. باستخدام طرف ماصة سعة 10 ملليلتر ، من الممكن فصل الخلايا إلى كتل خلايا صغيرة.

اجمع هذه الركام في أنبوب سعة 15 مليلتر ، وبعد أن تستقر لمدة ثلاث دقائق تقريبا ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط EB وانقل كل شيء إلى بئر واحد من لوحة تثبيت منخفضة بستة آبار. احتضن هذا الطبق طوال الليل في اليوم التالي. افحصها بحثا عن قطع مستعمرة كبيرة.

إذا تم العثور على أي منها. قم بتقسيمها عن طريق تدفقها عبر ماصة سعة خمسة ملليلتر عدة مرات. إذا كان هناك العديد من الخلايا المفردة العائمة ، فقم بجمع الركام عن طريق الترسيب واستبدلها بوسط EB جديد.

استبدل الوسائط كل يومين بعد خمسة أيام من الزراعة. اجمع مجاميع الخلايا واغسلها مرة واحدة باستخدام ملليلترين من PBS مما يسمح للخلايا بالترسيب تحت الجاذبية الطبيعية. ثم استبدل PBS بثلاثة ملليلتر من وسط DM وأعد الخلايا إلى نفس الآبار الصفيحية خلال ال 15 يوما القادمة من الزراعة.

استبدل الوسيط كل ثلاثة أيام. خلال هذا الوقت ، سوف تتشكل الغلاف المتوسط. أصيبت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بالحمام 60 درجة مئوية التي تحمل مضان GFP.

بعد 72 ساعة ، تم فرز الحقائق في الزنزانات. نمت الخلايا التي تعبر عن BAF 60 C إلى حوالي 75٪ من الطلاقة المشتركة ثم أصيبت بفيروس العدسات العضلية D. تم الكشف عن التعبير الجيني الخارجي في الخلايا المصابة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي.

تم فحص التعبير والتوزيع على مستوى البروتين. يتوافق GFP التالي مع تعبير baf 60 C ، وتم استخدام جسم مضاد myo D للتحقق من تعبير myo D. بعد 15 يوما من بدء الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في تكوين EB مثل الركام.

تم تضمين جزء من كرات myos في مركب OCT وقسم القسم الملطخ بشكل إيجابي لعلامات السلسلة الثقيلة والعضلية. بدءا من اليوم 10 ، كان من الممكن ملاحظة انكماش متقطع في مجالات myos. اتخذت بعض كرات myos أشكالا مختلفة أو غير عادية ، ربما بسبب الاندماج بين كرات myos.

ستعمل هذه التقنية على تعزيز البحث في مجال نمذجة الأمراض وعلاجها لأنه يمكن إنشاء المجالات العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات للمرضى المصابين باضطرابات عضلية مختلفة. لهذا السبب ، توفر المجالات العضلية نموذجا مناسبا للمرض في الإصدار المناسب لتنظيف الأدوية والتسبب في المرض.