Name: مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة السل المتفطرة التضخيم ميكروأري (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: اكتشف طريقة المصفوفات الدقيقة التضخيمية لتنميط جينات السل المتفطرة متعدد المقاومة للأدوية. تُبسّط هذه التقنية التشخيص مع الحفاظ على حساسية PCR وقدرة التعدد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في إطار منحة RC3 AI089106. وقدمت السل المقاوم للأدوية المتعددة الأحماض النووية من قبل برنامج الأمم المتحدة للطفولة برنامج / صندوق الأمم المتحدة للتنمية / البنك الدولي / منظمة الصحة العالمية الخاص للبحوث والتدريب في مجال أمراض المناطق المدارية، جنيف، سويسرا. نشكر الدكتور توم Shinnick من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها لتوجيهات بشأن الجينات والطفرات محددة لتدرج في مقايسة النموذج.

للمختبرات التي تتبع الاحتياطات العالمية PCR، فمن الناحية العملية أكثر كفاءة لتشمل العديد من ميكروأرس التضخيم وحشيات في الركيزة وغسل جميع ميكروأرس التضخيم في وقت واحد في حاوية كبيرة، كما هو موضح هنا. تنسيقات الاستهلاكية المتوفرة لأداء آخر التضخيم غسل ميكروأري الخطوات في مختومة تماما، مغلقة اختبار AMPLICON، كما ذكرت في مكان آخر 30،33. 1. الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج وتنقية الأحماض النووية من العينة تحت ظروف السلامة الأحيائية المناسبة مع طريقة الاختيار. الشرط هو ان تكون الأحماض النووية من النقاء ما يكفي لغير المتماثلة، متعدد PCR التضخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مساحة العمل عن طريق محو الأسطح والمعدات مع حلول إزالة التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الكواشف التضخيم على الجليد أو كتلة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب لمزيج الرئيسي التضخيم، وتسمية العقيمة 0.2 مل microfuge تويكون لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم إذابة الكواشف، لفترة وجيزة الدوامة وجمع محتويات في الجزء السفلي من أنبوب مع نبض تدور في الطرد المركزي صغيرة. لا دوامة طق البلمرة. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط وتابع مع نبض تدور في مصغرة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الرئيسي التضخيم باستخدام كميات رد فعل لكل عينة المبينة في الجدول 1. لمراعاة عدم دقة pipetting لممكن، وإعداد واحد على الأقل أكثر حجم رد الفعل من العدد الكلي للعينات التي يتم معالجتها. علما بأن مزيج الرئيسي يحتوي البلمرة طق إضافية، وفوق كل ما يتم توفيرها مع المخزن المؤقت PCR muliplex. إضافة فقط السيطرة التضخيم / تثبيط لمزيج الرئيسي بعد يتم الجمع بين جميع الكواشف الأخرى، وعاد أنابيب الأسهم كاشف للتخزين. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> لكل عينة الحجم (ميكرولتر) </td><td> &lt;قوية&gt; النهائي [] </td></tr><tr><td> Mulitplex PCR العازلة مع HotStar طق زائد </td><td> 25 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) </td><td> 0.55 </td><td> 0.6 ملغ / مل </td></tr><tr><td> الفورماميد </td><td> 3.8 </td><td> 7.6٪ </td></tr><tr><td> البلمرة طق إضافية </td><td> 0.8 </td><td> وحدة / ميكرولتر (المجموع 4 وحدات) </td></tr><tr><td> السل المقاوم للأدوية المتعددة التمهيدي مزيج </td><td> 15.75 </td><td> - </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز خالية H 2 O </td><td> 2.1 </td><td> - </td></tr><tr><td> التضخيم / التحكم في تثبيط </td><td> 1 </td><td> 5.0 FG / ميكرولتر </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 49 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. السل المقاوم للأدوية المتعددة التضخيم ميكروأري سيد مزيج تكوينها. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة مزيج الرئيسي وجمع محتويات في الجزء السفلي من أنبوب مع نبض تدور في الطرد المركزي صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 49 ميكرولتر من مزيج الرئيسي و 1 ميكرولتر من M. الحمض النووي السل إلى كل من أنابيب عينة من الخطوة 1.4 أعلاه. لخارجي، لا للتحكم القالب (NTC)، استخدم 1 ميكرولتر من الماء الجزيئية الصف البيولوجيا بدلا من م. عينة من الحمض النووي السل. دوامة ونبض تدور الأنبوب (ق) عند الانتهاء. </li></ol> 2 قم بتحميل التضخيم ميكروأرس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 48 ميكرولتر من كل مزيج سيد / العينة على مركز ميكروأرس كل منها، والحرص على عدم لمس ميكروأري نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع زلة غطاء على رأس طوقا ميكروأري والختم، والحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء في غرفة ميكروأري. يمكن فقاعات الهواء تؤثر سلبا على كفاءة التضخيموربما خلق التحف أو الضوضاء في الصورة ميكروأري اللاحقة. </li></ol> 3. ركوب الدراجات الحرارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحميل جميع ميكروأرس مع العينة، ركائز مكان على cycler الحرارية كتلة مسطحة. تأكد من أن الخيار غطاء ساخنة تشغيل &quot;إيقاف&quot;. وبالفعل تم الحصول عليها من أجهزة Akonni النظم البيولوجية يمكن تأهيله للاستخدام. خلاف ذلك، من المهم جدا للتحقق من أن كتلة cycler الحرارية المسطحة (ق) تقديم (ق) موحدة، التدفئة متناسقة عبر جميع ركائز ميكروأري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج cycler الحرارية، حدد البرنامج المناسب، أدخل &quot;50 ميكرولتر&quot; لحجم رد الفعل، والشروع في التشغيل. بروتوكول الدراجات الحرارية الموصوفة هنا تتكون من: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ركوب الدراجات الحرارية خطوات </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 88 ° C </td><td> 5 دقائق </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 88 ° C </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 ° C </td><td> 1 دقيقة </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 65 ° C </td><td> 30 ثانية </td></tr><tr><td> 5 </td><td> كرر الخطوات من (2-4) لمدة 50 دورات </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 65 ° C </td><td> 3 دقيقة </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 55 ° C </td><td> 3 ساعة </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العدد الإجمالي للدورات الحرارية و 55 درجة مئوية بعد التضخيم عقد الوقت هي المتغيرات المستقلة أن المستخدم قد تعدل، حسب الحاجة أو المناسبة للتجربة محددة. لأن مزيج الرئيسي السل المقاوم للأدوية المتعددة يخلق غير المتماثلة amplicons (في الغالب الذين تقطعت بهم السبل واحد)، فإنه من المفيد عادة لتشمل دورات أكثر الحرارية عما يمكن استخدامها لالتقليدية، الأسي بروتوكول التضخيم PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند البرنامج ركوب الدراجات والتهجين الحرارية كاملة، إنهاء البرنامج، وإزالة ميكروأرس التضخيم، أغلق البرنامج، وإيقاف cycler الحرارية (ق).</li></ol> 4. غسل والجافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل ما يصل الى 24 في وقت واحد ركائز، وإعداد 250 مل على الأقل 1X SSPE - 0.1٪ تريتون X-100 غسل العازلة، وحاويتين مع لا يقل عن 250 مل منزوع الأيونات أو الملة، س الصف المياه لكل منهما. في غسل العازلة يمكن أن تكون معدة مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية زلة تغطية وحشية من كل التضخيم ميكروأري الغرفة باستخدام ملقط نهاية مسطحة. هذه الخطوة هي النقطة التي يوجد فيها أكبر خطر ضررا جسديا صفائف عنصر هلام. استخدام الضوابط المناسبة التلوث PCR لمنع انتشار الأحماض النووية تضخيمها داخل بيئة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ركائز ميكروأري في حامل الشريحة الأنسجة، ووضع كافة الشرائح في غسل بن تحتوي على غسل العازلة. تغطية الحاويات مع غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ميكروأرس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع ميكروأرس كل ثلاث مرات في اثنين من يغسل المتعاقبة منزوع الأيونات أوملي-Q المياه الصف، والهواء الجاف. </li></ol> 5. التصوير وغير المتماثلة السل المقاوم للأدوية المتعددة التمهيدي مزيج يولد amplicons CY3 المسمى. ولا يمكن تصوير ميكروأرس عنصر هلام مع أي معيار ميكروأري تصوير قادرة على CY3 التصوير. الإجراء التالي هو التصوير محددة لمزيج السل المقاوم للأدوية المتعددة الماجستير، مجال Dx2100 تصوير المحمولة، وبرامج التحليل الآلي التي تقدمها Akonni. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من توصيل كابل إيثرنت من تصوير إلى جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تصوير. يقع مفتاح الطاقة على اللوحة الخلفية للأداة. سوف المصابيح الزرقاء على الجزء الأمامي من تصوير تضيء عندما يتم تشغيل تصوير جرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سطح المكتب الكمبيوتر، انقر نقرا مزدوجا على أيقونة البرنامج لإطلاق برنامج تحليل الصور الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر البرنامج لتأسيس اتصال مع كاميرا تصوير. بمجرد تأسيس الاتصال، يصبح الزر تحليل المتاحة، ورسالة &quot;اتصال ناجح&quot; سوف تظهر في الزاوية اليسرى السفلى من الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ميكروأري التضخيم المجففة مع ميكروأري تواجه بعيدا عن المستخدم، ونحو عدسة الهدف. إذا تم الموجهة ميكروأري غير صحيح فيما يتعلق عدسة الكاميرا و، ستفشل برامج التحليل الآلي لوضع شبكة على الصورة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق باب الوصول. معاينة الصورة سوف تكون متاحة على شاشة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التحليل النصي السل المقاوم للأدوية المتعددة من القائمة المنسدلة وأدخل وقت التعرض المطلوب (بالمللي ثانية). وهناك نقطة انطلاق نموذجية للعنصر هلام ميكروأرس التضخيم هو 100-500 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتم عرض بكسل المشبعة على معاينة الصورة باللون الأحمر. ضبط الوقت التعرض لتقليل عدد وحدات البكسل المشبعة في مواضع فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق تحليل لاكتساب وتحليل صورة مضان. البرنامج سيضع تلقائياالسل المقاوم للأدوية المتعددة الشبكة مقايسة محددة على الصورة، واستخراج كثافة متكاملة والقيم الأساسية، وتقديم تقرير عن نتائج مقاومة المخدرات والتنميط الجيني. فإن التحليل الآلي تأخذ عادة بضع ثوان. للصور التحدي التي تحتوي على الخدوش والغبار والتحف الفلورسنت، أو الأضرار المادية إلى ميزات ميكروأري، البرنامج قد تحتاج ما يصل الى 1 دقيقة لاستكمال التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تحليل كاملة، انقر على حفظ، حدد المجلد الوجهة، اكتب اسم الملف، ثم انقر فوق موافق. يتم حفظ البيانات ميكروأري الأساسية كملف XLS. ويمكن تصديرها للخارج الخط يحلل، إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تحليل كاملة، وإزالة ميكروأري التضخيم من تصوير وانقر على جديد لبدء تحليل المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من جمع البيانات، وإغلاق البرامج، إيقاف تشغيل الكمبيوتر، وإيقاف تصوير. </li></ol>

<ol><li>Lemaire, J. -F., Casenghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+diagnostics+for+tuberculosis%3A+fulfilling+patient+needs+first%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+AIDS+Soc%22%5BJournal%5D)">New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first.</a> J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tuberculosis+diagnostic+technology+landscape%22">Tuberculosis diagnostic technology landscape</a>. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).</li>
<li>Notomi, T., Okayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucl. Acids Res. 28, e63(2000).</li>
<li>Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicase-dependent+isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Helicase-dependent isothermal DNA amplification.</a> EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).</li>
<li>Pritchard, C. G., Stefano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+detection+of+viral+nucleic+acid+at+subattomole+levels+using+Q+beta+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase.</a> Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).</li>
<li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li>
<li>Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal%2C+in+vitro+amplification+of+nucleic+acids+by+a+multienzyme+reaction+modeled+after+retroviral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).</li>
<li>Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+chip+array+for+differentiation+of+mycobacterial+species+and+detection+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance.</a> Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).</li>
<li>Troesch, A., Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+species+identification+and+rifampin+resistance+testing+with+high-density+DNA+probe+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).</li>
<li>Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+TB-biochip+oligonucleotide+microarray+system+for+rapid+detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).</li>
<li>Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+defined+Mycobacterium+tuberculosis+populations+using+RNA+amplification+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies.</a> BMC Genomics. 9, 94(2008).</li>
<li>Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+mycobacterium+species+isolates+by+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).</li>
<li>Park, H., Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genotyping+of+Mycobacterium+species+from+clinical+isolates+and+specimens+by+oligonucleotide+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).</li>
<li>Yao, C., Zhu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rpoB%2C+katG+and+inhA+gene+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+isolates+from+Chongqing+as+determined+by+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).</li>
<li>Sun, A. H., Fan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+rpoB+gene+mutations+in+rif-resistant+M.+tuberculosis+isolates+by+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray.</a> Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).</li>
<li>Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).</li>
<li>Fu, L., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+action+of+INH+on+a+highly+INH-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain+using+Genechips%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips.</a> Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).</li>
<li>Fu, L. M., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+exploration+of+the+drug+action+of+capreomycin+on+Mycobacterium+tuberculosis+using+Affymetrix+oligonucleotide+GeneChips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect%22%5BJournal%5D)">Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips.</a> J. Infect. 54, 277-284 (2007).</li>
<li>Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+pncA+genotyping+of+pyrazinamide-resistant+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).</li>
<li>Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hybridisation+on+oligonucleotide+microarrays+for+analysis+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).</li>
<li>Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+and+allele+specific+PCR+detection+of+point+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+genes+associated+with+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance.</a> J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).</li>
<li>Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+mapping+of+mutations+of+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).</li>
<li>Yue, J., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampin-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+by+using+a+specialized+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).</li>
<li>Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CombiChip+Mycobacteria+Drug-Resistance+detection+DNA+chip+for+identifying+mutations+associated+with+resistance+to+isoniazid+and+rifampin+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).</li>
<li>Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+macroarrays+for+the+identification+of+MDR+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).</li>
<li>Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+genotype+MTBDR+line+probe+assay+for+detection+of+resistance+to+rifampin+and+isoniazid+in+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+low-+and+high-level+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).</li>
<li>Padilla, E., Gonzalez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+the+new+version+of+the+INNO-LiPA+Mycobacteria+and+GenoType+Mycobacterium+assays+for+identification+of+Mycobacterium+species+from+MB%2FBacT+liquid+cultures+artificially+inoculated+with+mycobacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains.</a> J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).</li>
<li>Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+performance+of+the+GenoType+MTBDRplus+Version+2+line+probe+assay+is+equivalent+to+that+of+the+Xpert+MTB%2FRIF+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay.</a> J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).</li>
<li>Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+line+probe+assay+for+rapid+identification+of+pncA+mutations+in+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).</li>
<li>Chandler, D. P., Bryant, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+amplification+microarrays+for+infectious+disease+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics.</a> Microarrays. 1, 107-124 (2012).</li>
<li>Vincent, V., Rigouts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TDR+Tuberculosis+Strain+Bank%3A+a+resource+for+basic+science%2C+tool+development+and+diagnostic+services%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Tuberc.+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).</li>
<li>Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-volatile+copolymer+compositions+for+fabricating+gel+element+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays.</a> Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).</li>
<li>Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plastic%2C+disposable+microfluidic+flow+cell+for+coupled+on-chip+PCR+and+microarray+detection+of+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents.</a> Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).</li>
<li>Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplicon+secondary+structure+prevents+target+hybridization+to+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).</li>
<li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sloppy+molecular+beacon+probes+for+identification+of+Mycobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).</li>
<li>Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+tuberculosis+and+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم وأملت في نهاية المطاف من كفاءة متعددة غير المتماثلة PCR، وليس ميكروأري. في تجربتنا، 10-12 أزواج التمهيدي فريدة من نوعها يمكن بسهولة المضاعفة في شكل التضخيم ميكروأري. وبالتالي تطبيق التمهيدي والتحقيق معايير التصميم التقليدية لفحوصات جديدة، إلا أن واحدا يحتاج أيضا إلى النظر في التفاعلات المحتملة بين حل مرحلة الأحماض النووية وتحقيقات ميكروأري يجمد، والكفاءة الحرارية للcycler الحرارية، والسلوك التحقيق التهجين في منطقة عازلة PCR أن أيضا يحتوي الاشعال PCR ...

وتعتبر اكتشاف الحالات المبكر والعلاج السريع للاستراتيجيات المكافحة الأكثر فعالية للحد من المتفطرة السلية (MTB) نقل 1، وهناك الآن توافق واسع في المجتمع السل أن نقطة الرعاية (مركز عمليات) أو بالقرب من مركز عمليات اختبار لتشخيص السل في وقت واحد وهناك حاجة المقاومة للأدوية (DR). تقنيات مثل GeneXpert Cepheid وغيرها من اختبارات الحمض النووي التضخيم تقليل الوقت لتشخيص لكثير من مرضى السل، وتقديم قراءة التدريجي السريع تشير إلى المقاومة ريفامبين أو الطفرات اختيارها تمنح المقاومة لغيرها من أدوية الخط الأول أو الثاني 2. على الرغم من أن مصممة في الوقت الحقيقي واختبارات الحمض النووي متساوي التضخيم لتحديد الطفرات المقاومة للعقاقير التي تؤدي إلى مرض السل المقاوم للأدوية المتعددة، فإن الطيف من الطفرات التي غالبا ما تكون غير كافية كشف لتصميم نظام المخدرات فردية المقابلة لملف المقاومة للأدوية للمريض، والقيود الفنية المتعلقةلالبصرية عبر الحديث أو تعقيد التضخيم والإبلاغ كيمياء مايو 3-7 تحديد عدد مواضع أو الطفرات التي يتم الكشف عنها. وبالتالي، هناك حاجة تكنولوجيات الكشف بسعة مضاعفة أعلى لمعالجة الثغرات المعروفة في التشخيص POC السل المقاوم للأدوية. يمكن ميكروأرس وأيدت منظمة الصحة العالمية، هين المقايسات خط التحقيق مواجهة &quot;الجينات متعددة، والطفرات متعددة&quot; تحديا لتشخيص السل المقاوم للأدوية المتعددة 8-29. للأسف، هذه، المنصات كشف المضاعفة القائم على التهجين استخدام متعددة الخطوات، معقدة، والبروتوكولات AMPLICON المفتوح التي تتطلب التدريب الهامة والكفاءة في التقنيات الجزيئية. تم تصميم ميكروأري التضخيم 30 لمعالجة بعض هذه ميكروأري تدفق العمل والاهتمامات التشغيلية. مبادئ فلويديك تبسيط هي لتضخيم، هجن، وكشف الأهداف الحمض النووي داخل غرفة ميكروفلويديك واحد. المستخدم يدخل حمض النووي والتضخيم ماسثالثا خلط في غرفة فلويديك مع ماصة ويبدأ بروتوكول الدراجات الحرارية. للأسلوب تجهيز الدفعات المعروضة هنا، يتم غسلها بعد ذلك في حل ميكروأرس السائبة، والمجففة، وتصويرها. وتوضح هذه الدراسة وظائف لميكروأري التضخيم باستخدام اختبار السل المقاوم للأدوية المتعددة ميكروأري لrpoB (30 الطفرات)، katG (2 الطفرات)، INHA (4 طفرات)، rpsL (2 الطفرات)، embB (1 الطفرة)، IS1245، IS6110 ، والتضخيم الداخلية والسيطرة التهجين. يتم تضمين واحد على الأقل زوج متطابق من تحقيقات ميكروأري (wildtype (WT) ومتحولة واحدة النوكليوتيدات (MU)) لكل طفرة من الاهتمام. الأحماض النووية تنقيته من مقاومة M. أدوية المتعددة السل هي من سلالة السل تقرير التجارة والتنمية 31 بنك. يتم تصنيع ميكروأرس عنصر هلام على ركائز الزجاج بواسطة البلمرة أساسا كما هو موضح في مكان آخر 32، إلا أن نستخدم 4٪ و 0.05 ملي مونومر كل التحقيق في polymerizخليط أوجه. وتحيط صفائف مع طوقا 50 مل قبل استخدامها. بعد ركوب الدراجات الحرارية، والتهجين، وغسل الخطوات، يتم تصوير ميكروأرس التضخيم على محلل المحمولة Akonni. ويتم الحصول على لتصحيح الخلفية، شدة إشارة متكاملة من الخام. معرض طرابلس الصور باستخدام خوارزمية دائرة ثابتة. يتم احتساب الضوضاء لكل عنصر هلام إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري من الخلفيات بقعة المحلية. تعتبر الأهداف الجين عادة للكشف عن إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) تقدر ≥ 3. من أجل تحديد وجود أو عدم وجود طفرة محددة في كل الجينات أو رامزة، ويتم احتساب نسبة التمايز من القيم SNR باسم (WT-MU) / (WT + MU). نسب التمايز &lt;0 تدل على طفرة مقاومة المخدرات في مكان الجريمة، في حين أن نسب&gt; 0 تدل على تسلسل من النوع البري.

<table><tbody><tr><td>مصفوفات دقيقة لتضخيم MDR-TB ، مع حشية مطبقة وزلات غطاء مقطعة مسبقا</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr> Multiplex <tr><td>PCR kit ، تحتوي على 2X مخزن PCR مع HotStar Taq plus</td><td>Qiagen</td> <td># 206143</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Qiagen</td> <td># 201207</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Qiagen</td> <td># 206143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>ثيرمو فيشر العلمي ، إنك.</td><td>#BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ملغ مل < سوب>-1 ألبومين مصل بقري غير أسيتلي (BSA)</td> <td>سيجما ألدريتش</td> <td>#3B6917</td><td></td></tr><tr><td>5X مزيج التمهيدي المركز</td><td>MDR-TB Akonni Biosystems</td><td>استفسر</td><td></td></tr><tr><td>500 fg uL-1 التحكم في التضخيم والتثبيط</td><td>Akonni Biosystems</td><td>استفسر</td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td>Thermo Fisher Scientific، Inc. </td><td>#BP1328-4</td><td></td></tr><tr><td>تريتون X-100</td><td>ثيرمو فيشر العلمي ، إنك.</td><td>#BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>رذاذ مطهر&nbsp;</td><td>شركة التقنيات الحالية</td><td>#BRSPRAY128</td><td></td></tr><tr><td>70٪ من كحول الأيزوبروبيل</td><td>ديكون لابز، إنك.</td><td># 8416</td><td></td></tr><tr><td>جهاز تصوير المصفوفات الدقيقة ، مع برنامج تحليل الصور والبيانات الآلي</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-20011</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler مع إدراج كتلة</td><td>مسطحة Akonni Biosystems</td><td>100-10021</td><td></td></tr><tr><td>محطة غسيل عالية الإنتاجية وحامل الشريحة</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>تشريح ملقط</td><td>Thermo Fisher Scientific، Inc.</td><td># 10-300</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vortexer</td><td>VWR</td> <td># 3365040</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>صغير VWR</td> <td># 93000-196</td><td></td></tr><tr><td>طقم ضاغط البخاخة</td><td>الهوائي</td> <td>المركزي # 95630</td><td></td></tr></tbody></table>

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق السل المقاوم للأدوية المتعددة التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل. وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع، واختيار حجم الهدف، ووضع العلامات المستهدفة، وميكروأري التهجين ضمن حل واحد وإلى غرفة ميكروفلويديك واحد. ويتجلى أسلوب تجهيز الدفعات مع مزيج الرئيسي غير المتماثلة 9-بلكس ومنخفض الكثافة عنصر هلام ميكروأري التنميط الجيني للأدوية المتعددة والسل المتفطرة مقاومة (السل المقاوم للأدوية المتعددة). بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تكتمل في 6 ساعة وتوفير التنميط الجيني الصحيح مع ما لا يقل عن المعادل 1،000 خلية من خلايا الحمض النووي الجيني. دمج على رقاقة خطوات غسل غير مجدية، الأمر الذي سيؤدي في طريقة AMPLICON مغلقة تماما والنظام. مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم مقيدة في نهاية المطاف من قبل عدد من أزواج التمهيدي التي يمكن دمجها في رئيسية واحدة مالتاسع ومازال تحقيق حساسية المرجوة ومقاييس الأداء والنوعية، بدلا من عدد من التحقيقات التي يجمد على صفيف. وبالمثل، فإن مجموع الوقت التحليل يمكن اختصارها أو تطول تبعا لاستخدام محدد المقصود، سؤال البحث، وحدود المطلوب من الكشف. ومع ذلك، فإن النهج العام يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي عن طريق تقليل عدد الخطوات مكثفة وتستغرق وقتا طويلا يدويا التجهيز، ويوفر طريقا البيوكيميائية وميكروفلويديك مبسطة لترجمة التشخيص القائم على ميكروأري في الممارسة السريرية الروتينية.

يمكن تحليل الصور النوعية توفر نظرة ثاقبة مصادر الضوضاء التجريبية أو تقلب التي تتحدى لتحديد الجداول في البيانات التي تولدها الآلي برمجيات تحليل الصور. وبالتالي، يمكن أن يكون مفيدا لبصريا التأكد من أن 1) جميع عناصر هلام سليمة وغير التالفة، 2) الخلفية العالمية غير خالية من القطع الأثرية الفلورسنت التي قد تؤثر على إشارة إلى نسبة الضوضاء الفردية (SNR) القيم، 3) ليس هناك أي دليل ل تشكيل فقاعة أو غير منتظم التضخيم / التهجين عبر مجموعة، و4) أن البرنامج حدد بدقة جميع البقع على الصورة ميكرو...

وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع وميكروأري التهجين في غرفة واحدة، والذي يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي. تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل.

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

الهدف العام من التجربة التالية هو النمط الجيني لبكتيريا السل الدقيقة المقاومة للأدوية المتعددة ، باستخدام مصفوفة دقيقة للتضخيم. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل متعدد الإرسال فوق الجزء العلوي من المصفوفة الدقيقة داخل غرفة تفاعل ميكروفيليديك واحدة. هناك يتم تضخيم العينة في وقت واحد ، وتحديد الحجم المسمى ، وجعلها مفردة تقطعت بهم السبل ، وتهجينها إلى المصفوفة الدقيقة.بعد ذلك ، بعد غسل المصفوفة الدقيقة ، يوضح القارئ ما إذا كانت البكتيريا الدقيقة السلية موجودة ، وما إذا كانت تحتوي على طفرة في الحمض النووي معروفة بأنها تمنح مقاومة للريفامبين ISO أو نيازي إيثامبوتول أو الستربتومايسين. تتمثل ميزة هذه الطريقة على مسبار خط المصفوفات الدقيقة الحالية أو طرق تهجين الحمض النووي في أن المصفوفة الدقيقة للتضخيم تبسط بشكل كبير تفاعل المستخدم مع الاختبار. ومع ذلك ، مع توفير الحساسية التحليلية ل PCR وقدرة تعدد الإرسال للمصفوفة الدقيقة لهذا الإجراء ، قم بمسح مساحة عمل نظيفة بمحلول مطهر وتحتوي على أحماض نووية نقية بما يكفي لتعدد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).بعد إذابة وخلط جميع محاليل المخزون ، قم بتجميع مزيج PCR الرئيسي. عند تحضير هذا المزيج ، اصنع حجما إضافيا واحدا على الأقل من الخليط لاختبار السل الموضح هنا. أضف أيضا بوليميراز T إضافيا إلى المزيج الرئيسي.بالإضافة إلى كمية التثبيت المتوفرة مع كواشف المخزون ، امزج ميكرولتر واحد من عينة الحمض النووي إلى 49 ميكرولترا من المزيج الرئيسي. أضف بعناية 48 ميكرولترا من كل خليط تفاعل إلى مركز المصفوفة الدقيقة المناسبة. لا تلمس المصفوفة الدقيقة نفسها.ثم قم بتغطية المصفوفة الدقيقة وإغلاقها بعناية بشكل غير صحيح. يمكن أن يؤدي تطبيق زلة الغطاء إلى ظهور فقاعات قد تؤدي إلى القطع الأثرية أو التبخر أو ضعف التضخيم أو التهجين غير المنتظم. يمكن أن يؤدي أي من هذه الحالات إلى نتيجة خاطئة.بعد ذلك ، قم بتحميل المعدل الجزئي في التدوير الحراري. مع وجود ركائز مقابل كتلة الحرارة ، يجب إيقاف تشغيل خيار الغطاء الساخن. بالنسبة للمختبرات التي تتبع احتياطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الشاملة ، من الأفضل تضمين العديد من المصفوفات الدقيقة للتضخيم لكل شريحة ومعالجة اختبارات متعددة في وقت واحد.الآن ، قم بتشغيل برنامج ركوب الدراجات الحرارية المناسب. يحتوي هذا البرنامج على 50 دورة تضخيم ، والتي قد تبدو عالية ولكنها ضرورية بسبب مجموعة الأمبليكون التي تقطعت بهم السبل في الغالب والتي تم إنشاؤها بواسطة التفاعل. عند اكتمال التفاعل ، قم بإزالة المصفوفات الدقيقة وإيقاف تشغيل المدورة الحرارية.افتح غرفة المصفوفة الدقيقة بعناية باستخدام ملقط ومسطح. قم بإزالة الانزلاق والغطاء والحشية. يمكن أن تتلف المصفوفة الدقيقة من هذه الخطوة ، لذا كن حذرا بشكل غير صحيح.يمكن أن تؤدي إزالة مجموعة الحشية إلى تلف مادي للمصفوفة الدقيقة. احرص على عدم ثني أو ثني زلة الغطاء واحرص بشدة على تجنب خدش سطح المصفوفة الدقيقة بالملقط ، الآن انقل ركائز المصفوفة الدقيقة إلى حامل شريحة النسيج. استحم الركائز في مخزن الغسيل المؤقت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف ، واتبع حمام محلول الغسيل بغسلتين أو ثلاث غسلات أخرى ، كل ذلك في ماء منزوع الأيونات.جفف المصفوفات الدقيقة قبل الشروع في التصوير. يمكن استخدام تيار لطيف من الهواء المضغوط لهذا الغرض في هذا العرض التوضيحي ، والمعلمات خاصة باختبار السل MDR وجهاز التصوير المحمول الميداني Econ DX 2100. يشير الضوء الأزرق على جهاز التصوير إلى أنه جاهز.قم بتشغيل الكمبيوتر. افتح برنامج النظام الذي يوفره أحد العملاء وانتظر حتى يعلن البرنامج أنه أنشأ اتصالا بالكاميرا. بعد ذلك ، أدخل المصفوفة الدقيقة المجففة في جهاز التصوير.مع المصفوفة الدقيقة باتجاه العدسة وبعيدا عن المستخدم. سيوفر البرنامج الآن صورة معاينة من القائمة المنسدلة. حدد البرنامج النصي لتحليل السل MDR.أدخل وقت تعريض ضوئي يتراوح بين 100 و500 مللي ثانية. ستتم قراءة وحدات البكسل المعرضة للضوء الزائد. اضبط التعريض الضوئي لتقليلها.عندما يتم ضبط التشبع على تقليل التعريض المفرط ، ابدأ التحليل. يضع البرنامج شبكة السل MDRT على درجات الصور والعينات وشدة الخلفية ، ثم يبلغ عن نتائج مقاومة الأدوية والتنميط الجيني. بمجرد اكتمال التحليل وحفظه ، قم بإزالة الشريحة من المصور وابدأ جلسة تحليل جديدة لتحليل المصفوفة التالية.استمر في التحليل لكل من المصفوفات الدقيقة المعالجة. حفظ البيانات في كل مرة. يمكن أن يوفر تحليل الصور النوعي نظرة ثاقبة لمصادر الضوضاء التجريبية أو التباين الذي يصعب تحديده في جداول البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج تحليل الصور الآلي.تظهر هنا مجموعة عالية الجودة تفتقر إلى القطع الأثرية. يمكن أن تؤدي العديد من القطع الأثرية إلى إدخال فقاعات تخلق هالات. على الرغم من القطع الأثرية للمصفوف، سيظل البرنامج يسترد القيم من المسح.خوارزمية إعداد التقارير التشخيصية ، على الرغم من الحصول على قيم معترف بها على أن هذه المصفوفة غير صالحة. تم استخدام سلسلة تخفيف من الحمض النووي الجيني من النوع البري H 37 RA على قالب PCR ميكرو صفيف عند 6.25 بيكوغرام أي ما يعادل 1،250 خلية. تم الكشف عن جميع المجسات.قيمة SNR أعلى من ثلاثة هي نتيجة إيجابية ، وكانت القيم المسجلة أعلى من ذلك بكثير. بعد ذلك ، تم تنميط العزلات المرجعية لمنظمة الصحة العالمية تم الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة الموجودة في المصفوفة على أنها الطفرة المقابلة في جينوم السل MDR.كما كانت هناك عدة أمثلة على اكتشاف الطفرات القريبة من الجيران. يتم توفير مناقشة في بروتوكول النص. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ثلاث ساعات ونصف إلى ست ساعات ونصف ، اعتمادا على تركيز الحمض النووي ، والفحص المحدد ، وكفاءة وتوحيد الدورة الحرارية ، والحساسية والخصوصية التحليلية أو السريرية المطلوبة.أيضا ، يمكن تقصير أو إطالة عدد دورات التضخيم وأوقات تهجين ما بعد التضخيم بسهولة للحصول على خصائص الأداء المطلوبة.

demonstrating-multi-drug-resistant-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات من المتفطرة السل يشكل تحديا لكنها حاسمة لرعاية المرضى. هذا الشكل لوحة microtiter يقدم اختبار مضاد المتفطرات 12 المخدرات ويوفر الحد الأدنى من تركيز المثبطة (MIC) القيم ، والتي سوف تساعد في العلاج المناسب.

اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

وMTB / RIF كسبيرت اختبار عينة يدمج إزالة التلوث، عملية خالية اليدين، على متن تجهيز العينات، وفائقة الحساسية PCR نصفي المتداخلة للكشف في وقت...

تشخيص السل الرئوي مع اختبار MTB / RIF كسبيرت

يوضح هذا الفيديو فحصا لتقييم فعالية الأدوية ضد عدوى المتفطرة السلية (Mtb). يتم إنشاء نموذج عدوى في المختبر يحتوي على مجاميع Mtb / البلاعم التي تحاكي العدوى في الجسم الحي. عند إدخال المضادات الحيوية المناسبة ، يتم اختبار فعاليتها عن طريق مقايسة ريسوزارين لمراقبة بقاء البكتيريا مع زيادة تركيزات الأدوية.

اختبار لتقييم فعالية الدواء ضد نموذج عدوى المتفطرة السلية

هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

النماذج والمقايسات الجديدة التي من شأنها تحسين عملية تطوير الأدوية المبكرة للأدوية من الجيل التالي من الأدوية المضادة للسل مرغوبة للغاية. هنا ، نصف مقايسة سريعة وغير مكلفة ومتوافقة مع BSL-2 لتقييم فعالية الدواء ضد المتفطرة السلية التي يمكن تكييفها بسهولة للفحص عالي الإنتاجية.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

نحن نصف اختبار فحص الحمل البكتيري الجزيئي السل أجريت بعد تنشيط الحرارة من البلغم. تعطيل الحرارة يجعل عينات البلغم غير معدية ويغني الحاجة إلى مختبرات الاحتواء من المستوى 3 للاختبارات الجزيئية للسل.

A السل الجزيئي ة الحمل البكتيري ة (TB-MBLA)

طورت هذه الدراسة اختبارا للفحص عالي الإنتاجية ضد خراج المتفطرة مع سلالة مراسل مزدوجة تم إنشاؤها مؤخرا ، باستخدام التألق واللألؤ لتقييم صلاحية البكتيريا بسرعة. سيكون هذا البروتوكول مناسبا للباحثين الذين يهدفون إلى فحص الأدوية الجديدة ضد هذه البكتيريا المقاومة للأدوية.

تطوير الفحص لفحص الأدوية عالي الإنتاجية ضد البكتيريا الفطرية

هنا ، نقدم طريقة رقاقة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي لتحديد أنواع المتفطرة ، والتي ستعمل على تحسين دقة التشخيص وكفاءة الأمراض ذات الصلة للاستخدام السريري.

تحديد أنواع المتفطرة بطريقة رقائق المصفوفة الدقيقة للحمض النووي

تحضير العينة من<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic

المتفطرة السلية تشكل الأغشية الحيوية المخدرات متسامح عندما تربيتها في ظروف معينة. نحن هنا وصف أساليب لزراعة M. الأغشية الحيوية والسل، وتحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح. وهذه البروتوكولات أن تكون مفيدة لمزيد من الدراسات في آليات التسامح المخدرات في م. مرض السل.

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

اكتشف طريقة المصفوفات الدقيقة التضخيمية لتنميط جينات السل المتفطرة متعدد المقاومة للأدوية. تُبسّط هذه التقنية التشخيص مع الحفاظ على حساسية PCR وقدرة التعدد.

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة

استكشف المزيد من الفيديوهات