مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة السل المتفطرة التضخيم ميكروأري

الهدف العام من التجربة التالية هو النمط الجيني لبكتيريا السل الدقيقة المقاومة للأدوية المتعددة ، باستخدام مصفوفة دقيقة للتضخيم. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل متعدد الإرسال فوق الجزء العلوي من المصفوفة الدقيقة داخل غرفة تفاعل ميكروفيليديك واحدة. هناك يتم تضخيم العينة في وقت واحد ، وتحديد الحجم المسمى ، وجعلها مفردة تقطعت بهم السبل ، وتهجينها إلى المصفوفة الدقيقة.

بعد ذلك ، بعد غسل المصفوفة الدقيقة ، يوضح القارئ ما إذا كانت البكتيريا الدقيقة السلية موجودة ، وما إذا كانت تحتوي على طفرة في الحمض النووي معروفة بأنها تمنح مقاومة للريفامبين ISO أو نيازي إيثامبوتول أو الستربتومايسين. تتمثل ميزة هذه الطريقة على مسبار خط المصفوفات الدقيقة الحالية أو طرق تهجين الحمض النووي في أن المصفوفة الدقيقة للتضخيم تبسط بشكل كبير تفاعل المستخدم مع الاختبار. ومع ذلك ، مع توفير الحساسية التحليلية ل PCR وقدرة تعدد الإرسال للمصفوفة الدقيقة لهذا الإجراء ، قم بمسح مساحة عمل نظيفة بمحلول مطهر وتحتوي على أحماض نووية نقية بما يكفي لتعدد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

بعد إذابة وخلط جميع محاليل المخزون ، قم بتجميع مزيج PCR الرئيسي. عند تحضير هذا المزيج ، اصنع حجما إضافيا واحدا على الأقل من الخليط لاختبار السل الموضح هنا. أضف أيضا بوليميراز T إضافيا إلى المزيج الرئيسي.

بالإضافة إلى كمية التثبيت المتوفرة مع كواشف المخزون ، امزج ميكرولتر واحد من عينة الحمض النووي إلى 49 ميكرولترا من المزيج الرئيسي. أضف بعناية 48 ميكرولترا من كل خليط تفاعل إلى مركز المصفوفة الدقيقة المناسبة. لا تلمس المصفوفة الدقيقة نفسها.

ثم قم بتغطية المصفوفة الدقيقة وإغلاقها بعناية بشكل غير صحيح. يمكن أن يؤدي تطبيق زلة الغطاء إلى ظهور فقاعات قد تؤدي إلى القطع الأثرية أو التبخر أو ضعف التضخيم أو التهجين غير المنتظم. يمكن أن يؤدي أي من هذه الحالات إلى نتيجة خاطئة.

بعد ذلك ، قم بتحميل المعدل الجزئي في التدوير الحراري. مع وجود ركائز مقابل كتلة الحرارة ، يجب إيقاف تشغيل خيار الغطاء الساخن. بالنسبة للمختبرات التي تتبع احتياطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الشاملة ، من الأفضل تضمين العديد من المصفوفات الدقيقة للتضخيم لكل شريحة ومعالجة اختبارات متعددة في وقت واحد.

الآن ، قم بتشغيل برنامج ركوب الدراجات الحرارية المناسب. يحتوي هذا البرنامج على 50 دورة تضخيم ، والتي قد تبدو عالية ولكنها ضرورية بسبب مجموعة الأمبليكون التي تقطعت بهم السبل في الغالب والتي تم إنشاؤها بواسطة التفاعل. عند اكتمال التفاعل ، قم بإزالة المصفوفات الدقيقة وإيقاف تشغيل المدورة الحرارية.

افتح غرفة المصفوفة الدقيقة بعناية باستخدام ملقط ومسطح. قم بإزالة الانزلاق والغطاء والحشية. يمكن أن تتلف المصفوفة الدقيقة من هذه الخطوة ، لذا كن حذرا بشكل غير صحيح.

يمكن أن تؤدي إزالة مجموعة الحشية إلى تلف مادي للمصفوفة الدقيقة. احرص على عدم ثني أو ثني زلة الغطاء واحرص بشدة على تجنب خدش سطح المصفوفة الدقيقة بالملقط ، الآن انقل ركائز المصفوفة الدقيقة إلى حامل شريحة النسيج. استحم الركائز في مخزن الغسيل المؤقت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف ، واتبع حمام محلول الغسيل بغسلتين أو ثلاث غسلات أخرى ، كل ذلك في ماء منزوع الأيونات.

جفف المصفوفات الدقيقة قبل الشروع في التصوير. يمكن استخدام تيار لطيف من الهواء المضغوط لهذا الغرض في هذا العرض التوضيحي ، والمعلمات خاصة باختبار السل MDR وجهاز التصوير المحمول الميداني Econ DX 2100. يشير الضوء الأزرق على جهاز التصوير إلى أنه جاهز.

قم بتشغيل الكمبيوتر. افتح برنامج النظام الذي يوفره أحد العملاء وانتظر حتى يعلن البرنامج أنه أنشأ اتصالا بالكاميرا. بعد ذلك ، أدخل المصفوفة الدقيقة المجففة في جهاز التصوير.

مع المصفوفة الدقيقة باتجاه العدسة وبعيدا عن المستخدم. سيوفر البرنامج الآن صورة معاينة من القائمة المنسدلة. حدد البرنامج النصي لتحليل السل MDR.

أدخل وقت تعريض ضوئي يتراوح بين 100 و500 مللي ثانية. ستتم قراءة وحدات البكسل المعرضة للضوء الزائد. اضبط التعريض الضوئي لتقليلها.

عندما يتم ضبط التشبع على تقليل التعريض المفرط ، ابدأ التحليل. يضع البرنامج شبكة السل MDRT على درجات الصور والعينات وشدة الخلفية ، ثم يبلغ عن نتائج مقاومة الأدوية والتنميط الجيني. بمجرد اكتمال التحليل وحفظه ، قم بإزالة الشريحة من المصور وابدأ جلسة تحليل جديدة لتحليل المصفوفة التالية.

استمر في التحليل لكل من المصفوفات الدقيقة المعالجة. حفظ البيانات في كل مرة. يمكن أن يوفر تحليل الصور النوعي نظرة ثاقبة لمصادر الضوضاء التجريبية أو التباين الذي يصعب تحديده في جداول البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج تحليل الصور الآلي.

تظهر هنا مجموعة عالية الجودة تفتقر إلى القطع الأثرية. يمكن أن تؤدي العديد من القطع الأثرية إلى إدخال فقاعات تخلق هالات. على الرغم من القطع الأثرية للمصفوف، سيظل البرنامج يسترد القيم من المسح.

خوارزمية إعداد التقارير التشخيصية ، على الرغم من الحصول على قيم معترف بها على أن هذه المصفوفة غير صالحة. تم استخدام سلسلة تخفيف من الحمض النووي الجيني من النوع البري H 37 RA على قالب PCR ميكرو صفيف عند 6.25 بيكوغرام أي ما يعادل 1،250 خلية. تم الكشف عن جميع المجسات.

قيمة SNR أعلى من ثلاثة هي نتيجة إيجابية ، وكانت القيم المسجلة أعلى من ذلك بكثير. بعد ذلك ، تم تنميط العزلات المرجعية لمنظمة الصحة العالمية تم الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة الموجودة في المصفوفة على أنها الطفرة المقابلة في جينوم السل MDR.

كما كانت هناك عدة أمثلة على اكتشاف الطفرات القريبة من الجيران. يتم توفير مناقشة في بروتوكول النص. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ثلاث ساعات ونصف إلى ست ساعات ونصف ، اعتمادا على تركيز الحمض النووي ، والفحص المحدد ، وكفاءة وتوحيد الدورة الحرارية ، والحساسية والخصوصية التحليلية أو السريرية المطلوبة.

أيضا ، يمكن تقصير أو إطالة عدد دورات التضخيم وأوقات تهجين ما بعد التضخيم بسهولة للحصول على خصائص الأداء المطلوبة.