التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير العمود الفقري التغصني بدقة فائقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد الحصين الأولي للفئران أولا يسمى الخطوة الثانية هي تصور العمود الفقري المتغصني عن طريق تعداء وتلطيخ GFP. بعد ذلك ، يتم الحصول على أشواك شجيرية مسماة GFP بدقة فائقة باستخدام مجهر SIM.

الخطوة الأخيرة هي إعادة بناء بيانات الصورة الأولية إلى 3D جاهزة لتحليل الصور اللاحق. في النهاية ، يتم استخدام GFP الذي يعبر عن الخلايا العصبية الأولية في الحصين التي تم تصويرها بدقة فائقة لإظهار تغييرات طفيفة في مورفولوجيا العمود الفقري المتغصن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري متحد البؤر التقليدي ، هي أنها تسمح لك بدراسة مورفولوجيا العمود الفقري المتغصني بمزيد من التفصيل.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فحص الأسئلة الرئيسية المستمرة في علم الأعصاب مثل التغيرات الجزيئية والدوائية المعتمدة في شكل العمود الفقري المتغصن. يعتمد الفحص المجهري للإزالة المنظم على إسقاط أنماط الخط على العينة ، وهذا يعطي معلومات إضافية يمكن استخراجها بواسطة برنامج كمبيوتر ويعطي صورا حادة إضافية ويسمح لك بإلقاء نظرة على الميتوكوندريا MI والهياكل الصغيرة الأخرى في الخلية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما من أجل تحقيق إعادة بناء صحيحة لصورة بطاقة SIM أمر بالغ الأهمية لمتابعة الخطوات التي تمنحك جودة جيدة للبيانات الأولية.

الخطوة التحضيرية المهمة طلاء زلات الغطاء ، والعمل في غطاء رقائقي معقم. استخدم ملقطا معقما صغيرا لوضع زلات الغطاء الفردي في آبار مفردة من صفيحة 12 بئر. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول البولي ليسين إلى كل بئر لغمر زلات الغطاء.

بعد غسل الآبار ، أضف ملليلترا واحدا من وسط الطلاء واترك الغطاء ينزلق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل طلاء الخلايا. سيتم توضيح الإجراء من قبل HU هو SH طالب دكتوراه في مجموعتنا. بعد عزل جنين الفئران ، استخدم ملقطا دقيقا لإزالة المخيخ والتخلص منه من الدماغ.

افصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق عمل قطع سهمي على طول خط الوسط تحت مجهر تشريح ، واستخدم زوجا واحدا من الملقط الصغير لتثبيت الدماغ المتوسط برفق وإزالة الدماغ المتوسط. باستخدام زوج آخر من الملقط ، اترك ما تبقى من نصف الكرة الأرضية الذي يحتوي على القشرة والحصين سليما. بعد ذلك ، قم بإزالة السحايا بعناية ، وأعد توجيه الأنسجة بحيث يكون الحصين متجها لأعلى.

يمكن التعرف على الحصين من خلال هيكله المميز على شكل CS. باستخدام ملقط ناعم ، قم بتشريح الحصين وضعه في طبق جديد بحجم 30 ملم يحتوي على طبق بارد طازج X-H-B-S-S. بعد إزالة فرس النهر من جميع الأجنة ، احسب العدد الإجمالي لفرس النهر ثم قم بتقطيعها إلى قطع صغيرة.

اجمع القطع في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من X-H-B-S-S. بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، أضف ستة ميكرولترات من التربسين لكل حصين. بعد احتضان وغسل شظايا الحصين كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتقطيع الشظايا ببطء 30 مرة باستخدام ماصة القس المصقولة بالنار حتى يتم تشتيت جميع قطع الأنسجة بشكل متجانس في خلايا مفردة.

احرص على تجنب أي فقاعات. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الطلاء ، محذر مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بعد عد الخلايا باستخدام بذرة تلطيخ حيوية زرقاء ثلاثية ، 50 ، 000 خلية لكل بئر من 12 ، صفيحة بئر في مليلتر واحد من وسط الطلاء بحجم إجمالي يبلغ ملليلتر.

بعد هز الصفيحة لتوزيع الخلايا بالتساوي ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، استبدل 0.5 مل من وسط الطلاء بوسط استزراع يحتوي على 10 ميكرومولار FUDR. لنقل العدوى ، تضيف الخلايا العصبية استئصال الشحم.

تخلط بالتنقيط مع مزيج الحمض النووي وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في غطاء التدفق الرقائقي ، قبل 10 دقائق من نهاية خليط استئصال الدهون من الحمض النووي لمدة 30 دقيقة ، الحضانة ، ماصة الوسط المكيف من لوحة الثقافة الأصلية أو الأولى إلى 12 ثانية. طبق جيد وقم بتخزين هذه اللوحة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون في لوحة الثقافة الأولى.

تم استبدال الوسط المكيف بسرعة بمليلتر واحد من وسط الحضانة الدافئ لمنع الخلايا من الجفاف. ضع كلا اللوحين مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية حضانة استئصال الدهون للحمض النووي لمدة 30 دقيقة ، يكون مزيج استئصال الدهون في الحمض النووي جاهزا للإضافة إلى الخلايا.

أضف برفق 200 ميكرولتر من مزيج استئصال الدهون من الحمض النووي إلى كل بئر واحتضنه لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة لمدة 45 دقيقة ، استخدم ملقطا صغيرا لرفع زلات الغطاء التي تحمل الخلايا العصبية. اشطفها عن طريق غمسها في طبق طوله ثلاثة سنتيمترات يحتوي على وسط قاعدي عصبي طازج ودافئ وضعه في بئر.

في الثانية 12 ، لوحة بئر تحتوي على الوسط المكيف. ثم احتضان الخلايا العصبية المنقولة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. للتحضير للتلوين المناعي ، قم بشفط الوسط برفق من الآبار التي تحتوي على زلات الغطاء.

ثم أضف 500 ميكرولتر من 4٪ PFA الدافئ بعناية لمنع إتلاف التشعبات. بعد احتضان وغسل كتلة الخلايا بمحلول 1٪ T-B-S-B-S-A في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بعد الغسيل مرة أخرى ، أضف الجسم المضاد الأساسي المخفف في الحضانة ، واخلطه واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم احتضن طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع رج لطيف.

في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واغسله مرة أخرى من الآن فصاعدا ، وحافظ على زلات الغطاء محمية من الضوء. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد المترافق الفلوري الثانوي المخفف في الحضانة. تخلط وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

ثم قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي وغسل الخلايا باستخدام ملاقط دقيقة. قم بإزالة زلات الغطاء من الآبار وجفف أي TBS زائد بمنديل. أخيرا ، قم بتركيب زلات الغطاء باستخدام وسيط التثبيت وختمها بطلاء الأظافر.

لبدء تصوير بطاقة SIM ، قم بتشغيل الليزر 488 نانومتر ، ومصباح الزئبق ، ووحدة التحكم في المرحلة ، ووحدة التحكم في البيزو ، ومصباح الهالوجين للضوء المنقول. ابدأ تشغيل برنامج SIM في وضع و أو لوضع nsim. بعد وضع قطرة من زيت الغاطس على الهدف ، تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في قطرة الزيت.

ضع زلة الغطاء مع الخلايا العصبية في الحصين على مرحلة المجهر. حرك الهدف لأعلى حتى يلامس الزيت العينة. تذكر وضع غطاء فوق المسرح أثناء إجراء الاستحواذ لحماية العينة من الضوء المحيط وتعتيم الضوء في الغرفة قدر الإمكان.

في برنامج بطاقة SIM ، حدد التكوين البصري IFI وحدد كتلة مرشح فارغة للفحص البصري مع تركيز عينة إعداد الضوء الأبيض. بعد ذلك ، قم بإطفاء الضوء الأبيض وتشغيل المصباح الزئبقي. افتح الغالق وحدد المرشح الأخضر للبحث عن تغصنات ساطعة بما فيه الكفاية.

عند مواجهة تغصنات ساطعة بما فيه الكفاية وتركيز جزء من الاهتمام في مجال الرؤية ، أغلق الغالق. اضبط البرنامج على التكوين البصري 3D SIM 4 88 ، وإعدادات الكاميرا على النحو التالي. اضبط وضع القراءة على em.

احصل على ميغاهرتز واحد 16 بت. اضبط وقت التعرض على 100 مللي ثانية. اضبط طاقة الليزر على 5٪ اضبط كسب EM على 200.

مع ضبط سرعة التركيز البؤري على دقة إضافية، ركز على الكائن المثير للاهتمام. اضبط إعدادات الكاميرا بسرعة على النحو التالي. للحصول على قيمة شدة بين 30 ، 040 5 ، 000 ، اضبط طاقة الليزر على 0٪ إلى 20٪ اضبط وقت التعرض على 50 مللي ثانية إلى ثانيتين.

اضبط وضع القراءة على em. احصل على ميغاهرتز واحد 16 بت. اضبط كسب EM على صفر إلى 300.

اضبط كسب التحويل على x واحد إلى 5.1 x. اضبط تنسيق البث المباشر على no Benning. اضبط تنسيق الالتقاط على عدم وجود بينينغ.

بعد ذلك ، قم بتكوين إعدادات مكدس DZ الثلاثة في لوحة تسلسل ND على النحو التالي ، واضبط النطاق على ميكرونين. اضبط حجم الخطوة على 120 نانومتر وانقر فوق موضع الصفحة الرئيسية. ثم حدد التكوين البصري ، 3D SIM 4 88 في قسم lambda.

بعد تحديد 3D SIM كوضع الاستحواذ ، قم بتشغيل الحصول على تسلسل ND وحفظ البيانات الأولية ، يتم عرض التشعبات والعمود الفقري التغصني المصور باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وsim. أعيد بناء عمليات الاستحواذ من الصور متحدة البؤر وبطاقة SIM. تم تتبع التشعبات وتصنيف العمود الفقري تلقائيا باستخدام البرنامج بعد ضبط المعلمات الرئيسية مثل طول العنق وقطر العنق وقطر الرأس.

تظهر المناطق المعبأة عمودا فقريا شجيريا فرديا تم تصويره باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وسيم وإعادة بنائها من مداخن Z المقابلة لها ، مما يصور الاختلافات في الدقة والدقة في عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الناتجة. وفقا لبطاقة SIM ، كشف التحليل الكمي عالي الدقة لكل من قطر الرأس والرقبة أن الفحص المجهري sim يقيس أبعادا أصغر بكثير من الفحص المجهري متحد البؤر لنفس العمود الفقري الشجيري مما يشير إلى أن SIM قادرة على اكتشاف التغييرات الأصغر في مورفولوجيا العمود الفقري المتغصن. أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحصول على صور أولية عالية الجودة لإعادة بناء لاحقة أكثر صحة لنفس الصورة.

يمكن أن يكون الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية فعالا أيضا في تصوير الخلايا الحية ، مما يسمح بالتحقيق في ديناميكيات الخلايا مثل خلايا الهيلا أو الخلايا العصبية أو بكتيريا الإشريكية القولونية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية التحضير والتصور وشرح معيار الصورة من الخلايا العصبية الأولية في الحصين بدقة فائقة.