تسلسلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع وقياس هجرة وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية والسلفية العظمية الداخلية بالتتابع أثناء عملية إصلاح كسر العظام. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وسم الخلايا الموجبة لـ MX1 (المقاومة لفيروس الإنفلونزا/فيروس ميكسو) في الجسم الحي عن طريق حقن حمض poly(I:C)، ثم القضاء على الخلايا المكونة للدم الموجبة لـ MX1 المقيمة بواسطة التشعيع. وفي الخطوة الثانية، يتم إعطاء خلايا نخاع العظم من النوع البري بشكل منهجي للفئران التي تعرضت للتشعيع.

بعد ذلك، يتم إحداث كسور مجهرية في منطقة Cal لدى الفأر عن طريق الثقب بالإبرة. وأخيراً، يتم إجراء تصوير متسلسل حي داخل الجسم لعملية إصلاح الكسور المجهرية. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الصور الحية لتقييم ديناميكيات تدفق الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للعظم وتمددها في مواقع الكسور.

لذا، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصوير المتكرر في الجسم الحي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للعظم أثناء عملية التئام الكسر. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج التئام الكسور وهشاشة العظام، حيث توفر هذه الطريقة أداة جديدة لمراقبة الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للعظم والداخلية المنشأ في عمليات تجديد العظام وإصلاحها.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن إحداث الكسر الدقيق بأقل قدر من تلف الأنسجة والتصوير المتكرر للإصابة بالكسر داخل الجسم الحي دون تحفيز تكوين ندبات شديدة يمثلان أهمية كبيرة للطريقة ويشكلان تحدياً تقنياً. لوسم الخلايا الموجبة لـ MX1 داخل الجسم الحي، ابدأ بحقن 200 µL من poly acidic poly cyto ilic acid لكل 20 g من وزن فأر MX1 Cree reporter في التجويف البريتوني مرة كل يومين لمدة 10 أيام. بعد ذلك، وللقضاء على الخلايا المكونة للدم الموجبة لـ MX1 المقيمة، قم بتعريض الفئران المحقونة للإشعاع بجرعة واحدة قدرها 9.5 gras. وبعد مرور 24 ساعة، قم بزراعة 1 × 10⁶ من خلايا نخاع العظم من النوع البري وريدياً لكل فأر.

بعد مرور أربعة إلى ستة أسابيع، يتم تخدير الفأر عن طريق حقن 50 µL من ketamine xylazine داخل الصفاق. بعد التأكد من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم، يتم حلق فروة رأس الفأر الذي تم زرع خلايا نخاع العظم فيه، ثم تعقيم الجلد المكشوف باستخدام مسحة كحول 70%. يتم وضع جل الدموع لمنع جفاف القرنية، ثم يتم إجراء شق عرضي بطول أقل من سنتيمتر واحد عبر فروة الرأس، بدءاً من إحدى الأذنين وانتهاءً بالأخرى. بعد ذلك، يتم تدوير الحيوان بنحو 60 درجة ومواصلة الشق باستخدام الملقط حتى يصل إلى مسافة تتراوح بين 2 إلى 3 mm من الأنف.

اسحب سديلة الأنسجة نحو جانبي الحيوان لفصل الجلد، بحيث تصبح كل من العظام الجبهية وتقاطع الغرز السهمية والإكليلية مكشوفة بوضوح الآن. اشطف السطح المفتوح بمحلول PBS معقم، ثم امسح الشعيرات المتبقية برفق باستخدام مسحات قطنية. بعد ذلك، ولإحداث كسور مجهرية في الجمجمة، ثبت رأس الفأر بيد وإبرة بقياس 30 gauge باليد الأخرى.

استخدم سن إبرة قياس 30 gauge لإحداث ثقب دقيق بلطف في أحد جانبي العظام الجبهية بالقرب من تقاطع الدرز السهمي والإكليلي. ولتجنب اختراق الدماغ، انتقل إلى إبرة ذات قياس أكبر وقم بتدوير الإبرة الجديدة لتوسيع فتحة الثقب إلى قطر يبلغ حوالي 0.5 millimeters تقريبًا. بعد إحداث ثقب ثانٍ في العظم الجبهي المقابل، قم بتقطير PBS باستمرار في كل نقطة مع المسح حتى يتوقف النزيف.

ثم ولتجنب الجفاف، ضع قطرة كافية من محلول الملح الفسيولوجي المعقم على الجمجمة لتغطية المنطقة المراد الحصول على صور Vidal لها بشكل كامل. أولاً، قم بتشغيل الماسح الليزري القائم على المضلع للسماح بالاستحواذ المتزامن على الصور متعددة القنوات بمعدل فيديو يبلغ 30 إطاراً في الثانية. بعد ذلك، قم بتشغيل ليزر التيتانيوم ياقوت الفيمتوشانية للتصوير متعدد الفوتونات.

اضبط القدرة والطول الموجي على 880 nanometers لتصوير التوليد التوافقي الثاني لعظم القحف عند 440 nanometers لاستثارة GFP وTD tomato، ثم قم بتشغيل ليزرات الحالة الصلبة ذات الطول الموجي 491 nanometer و561 nanometer. بعد ذلك، قم بتشغيل كواشف أنبوب المضاعف الضوئي لكل إشارة: مرشح تمرير نطاق 435 ± 20 nanometer للتوليد التوافقي الثاني، ومرشح تمرير نطاق 528 ± 19 nanometer لـ GFP، ومرشح تمرير نطاق 590 ± 20 nanometer لـ TD tomato. الآن، ضع الحيوان على منصة مجهر آلية بمحاور XYZ فوق وسادة تسخين كهربائية مضبوطة على 37 °C.

استخدم شريطاً لاصقاً لتثبيت الفأر في موضعه، ثم ضع قطرة من هلام قائم على ميثيل السليلوز (Methylcellulose) بتركيز 2% ودافئ على الجمجمة. ولتجنب الجفاف، ضع غطاءً زجاجياً على منطقة التصوير. بعد ذلك، استخدم عدسة شيئية غمر مائي بقوة 30x وفتحة عددية 0.9 مع وحدة التحكم في المحاور XY وZ لرصد إشارة SHG المنبعثة من العظام.

للعثور على سطح الجمجمة، حدد موقع علامة مرجعية حاسمة مثل نقطة التقاء الغرز السهمية والغرز الإكليلية، ثم التقط صورة. حدد إحداثيات XY و Z للعلامة المرجعية، ثم واصل البحث عن موقع الإصابة باستخدام إشارات SHG والإشارات الفلورية كدليل. عند العثور على كل منطقة اهتمام، التقط صورة لأفضل مستوى بؤري يحتوي على إشارات SHG والإشارات الفلورية من الخلايا المستهدفة.

احفظ إحداثيات XY وZ والمسافة إلى تقاطع الدرز السهمي والإكليلي لتحديد موقعها الدقيق لجولة التصوير التالية. ثم قم بجمع الهياكل الخلوية والعظمية ثلاثية الأبعاد لإصابة الكسر. سجل الصور بفاصل Z stack يتراوح تقريباً بين 2 إلى 5 micron وبعمق يبلغ حوالي 100 micron من سطح العظم الداخلي.

أخيراً، وبعد تصوير كلا موقعي الإصابة، استخدم عدة قطرات من المحلول الملحي المعقم لإزالة هلام Methylcellulose بتركيز 2% من الجمجمة. قم الآن بتغطية السطح بالمضادات الحيوية وغطِ الجمجمة بـسدائل الجلد، ثم أعد إغلاق فروة الرأس باستخدام خيوط جراحية مضادة للحساسية وأبقِ الحيوان في غرفة تعافٍ دافئة حتى يستعيد وعيه بشكل كافٍ. بعد مرور ثلاثة إلى خمسة أيام، كرر خطوات التصوير الحي (Intravital imaging) لتتبع التغيرات الخلوية أثناء التئام الكسر.

في هذه التجربة النموذجية، تم إحداث كسرين دقيقين في العظام الجبهية لفئران GFP التي تحمل جين MX1 المرتبط ببروتين osteocalcin وtomato، وذلك بعد التعريض للإشعاع واستبدال نخاع العظم. أظهر التصوير الحي ثلاثي الأبعاد المتسلسل للكسور الدقيقة إعادة تموضع للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للعظم والموجبة لـ tomato داخل موقع الكسر في اليوم الثاني، بالإضافة إلى تمددها في اليوم الخامس. وعلى الرغم من عدم رصد أي خلايا بانية للعظم موجبة لـ GFP في هذا الوقت، إلا أنه في اليوم 12، بدأت مجموعة فرعية من الأسلاف العظمية القريبة من سطح الكسر في التمايز إلى خلايا بانية للعظم موجبة لـ tomato وموجبة لـ GFP كما يشير السهم. ويشير تراكم الخلايا البانية للعظم الجديدة وتكوين عظم جديد في اليوم 21 إلى أن هجرة وتكاثر الخلايا السلفية المكونة للعظم كانت آلية رئيسية لتوفير خلايا بانية للعظم جديدة لالتئام الكسر. ولاختبار ما إذا كانت هذه الطريقة توفر مخرجات متسقة وكمية لأعداد الأسلاف العظمية أثناء التئام الكسر، تم تتبع الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للعظم والموجبة لـ YFP في MX1 لمدة 14 يوماً بعد الإصابة.

تم اكتشاف أعداد صغيرة من الخلايا السلفية بشكل مستمر في موقع الإصابة بحلول اليوم الثالث. وازدادت أعداد الخلايا باستمرار في اليوم السابع، لتصل إلى ذروتها في اليوم 10 واستمرت عند هذا المستوى حتى اليوم 14. تم قياس حركية توليد الخلايا السلفية العظمية عن طريق قياس شدة إشارة YFP بمرور الوقت، وتم ربط ذلك بما لوحظ عبر المجهر الحي.

لُوحظت الخلايا السلفية لأول مرة في اليوم الثالث، ووصلت إلى ذروتها بحلول اليوم 10، وظلت بكثافة عالية مماثلة حتى اليوم 14. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تقنيات الخياطة الماهرة وتقليل النزيف يمكن أن يحدّا من تكوين الندبات ويقللا من التألق الذاتي للخلفية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير وتتبع هجرة وتكاثر وتمايز الخلايا السلفية الجذعية المكونة للعظم الداخلية في عملية إصلاح الكسور.