تسلسلي في الجسم الحي التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع وتحديد الهجرة والتكاثر والتمايز بين الخلايا الجذعية العظمية الداخلية والخلايا السلفية في إصلاح كسور العظام. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات الأولى على فيروس mixo ، ومقاومة فيروس الأنفلونزا ، وخلية واحدة أو MX واحدة موجبة في الجسم الحي عن طريق حقن حمض الإيليك بولي cyto poly cynic ، ثم القضاء على الخلايا المكونة للدم المقيمة MX واحدة عن طريق التشعيع. في الخطوة الثانية ، يتم إعطاء خلايا نخاع العظم البرية بشكل منهجي للفئران المشععة.

بعد ذلك ، يتم إنشاء الكسور الدقيقة في منطقة Cal للفأر عن طريق حفر الإبرة. أخيرا ، يتم إجراء التصوير المتسلسل داخل القارورة لإصلاح الكسر الدقيق. في النهاية ، يمكن استخدام هذه الصور داخل الحيوية لتقييم ديناميكيات تدفق الخلايا الجذعية العظمية والسلفية وتمددها في مواقع الكسر.

لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصوير المتكرر في الجسم الحي للخلايا الجذعية العظمية والخلايا السلفية أثناء التئام الكسور. امتد تأثير هذه التقنية إلى علاج التئام الكسور وهشاشة العظام. حيث تقدم هذه الطريقة أداة جديدة لمراقبة الخلايا الجذعية السلفية العظمية الذاتية في تجديد العظام وإصلاحها.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية كجيل من الكسر الدقيق مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة والتصوير المتكرر في الجسم الحي لإصابة الكسر دون التسبب في تكوين ندبة شديدة أمر مهم للطريقة ويمثل تحديا تقنيا لتسمية MX واحدة الخلايا الإيجابية في الجسم الحي تبدأ بحقن 200 ميكرولتر من حمض البولي سيتو الإيليك لكل 20 جراما من MX واحد كري مراسل وزن الفأر داخل الصفاق مرة كل يومين لمدة 10 أيام. ثم للقضاء على MX المقيم ، تقوم خلية مكونة للدم إيجابية واحدة بإشعاع الفئران المحقونة بجرعة واحدة من 9.5 جرا. بعد 24 ساعة ، قم بزرع مرة واحدة في 10 إلى خلايا نخاع العظم من النوع البري السادس عن طريق الوريد لكل فأر.

بعد أربعة إلى ستة أسابيع ، قم بتخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام 50 ميكرولتر من زيلازين الكيتامين بعد التأكد من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، قم بقص زوج فروة الرأس من الفأر المزروع بخلايا نخاع العظم ، ثم قم بتعقيم الجلد المكشوف بمسحة كحولية بنسبة 70٪. ضع جل المسيل للدموع لمنع جفاف القرنية ، ثم قم بعمل شق عرضي بطول أقل من سنتيمتر واحد عبر فروة الرأس ، بدءا من أذن واحدة وينتهي عند الأخرى. بعد ذلك ، اقلب حوالي 60 درجة واستمر في الشق حتى يصل إلى حوالي ملليمترات إلى ثلاثة ملليمترات من الأنف باستخدام الملقط.

اسحب رفرف الأنسجة باتجاه جوانب لفصل الجلد ، ويجب الآن أن تكون العظام الأمامية وتقاطع الغرز السهمية والإكليلية مكشوفة بوضوح. اغسل السطح المفتوح باستخدام PBS معقم ثم امسح الشعر المتبقي برفق بمسحات قطنية. ثم لتوليد كسور دقيقة على العجل ، أمسك رأس الفأر بيد وإبرة قياس 30 باليد الأخرى.

استخدم طرف الإبرة قياس 30 لحفر ثقب دقيق برفق على جانب واحد من العظام الأمامية بالقرب من تقاطع الغرز السهمية والإكليلية. لتجنب اختراق الدماغ ، قم بالتبديل إلى مقياس أكبر وقم بلف الإبرة الجديدة لتوسيع ثقب الثقب إلى حوالي 0.5 ملليمتر في القطر. بعد إحداث ثقب ثان على العظم الأمامي المقابل ، قم بإسقاط PBS باستمرار في كل بقعة للمسح حتى يتوقف النزيف.

ثم لتجنب الجفاف ، ضع قطرة كافية من المحلول الملحي الفسيولوجي المعقم على الجمجمة لتغطية المنطقة بالكامل للحصول على صور فيدال. قم أولا بتشغيل الماسح الضوئي بالليزر القائم على المضلع للسماح بالحصول على صور متعددة القنوات في وقت واحد بمعدل فيديو يبلغ 30 إطارا في الثانية. بعد ذلك ، قم بتشغيل ليزر الياقوت التيتانيوم الفيمتو ثانية للتصوير متعدد الفوتونات.

اضبط الطاقة والطول الموجي على 880 نانومتر للتصوير التوافقي الثاني للعظم الجليزي عند 440 نانومتر لإثارة طماطم GFP و TD ، وقم بتشغيل ليزر الحالة الصلبة 491 نانومتر و 561 نانومتر. ثم قم بتشغيل كاشفات أنبوب مضاعف الصور لكل إشارة مرشح تمرير نطاق 435 زائد أو ناقص 20 نانومتر للجيل التوافقي الثاني ، مرشح تمرير نطاق 528 زائد أو ناقص 19 نانومتر ل GFP وتمرير نطاق 590 زائد أو ناقص 20 نانومتر لطماطم TD. الآن ، ضع على مرحلة المجهر الآلي لمحور XYZ فوق وسادة تسخين كهربائية مضبوطة على 37 درجة مئوية.

استخدم شريطا لتثبيت الماوس في موضعه ثم ضع قطرة من الجل الدافئ القائم على ميثيل السليلوز بنسبة 2٪ على الجمجمة. لتجنب الجفاف ، ضع غطاء زجاجي على منطقة التصوير. ثم استخدم هدف الغمر في الماء 30 × بفتحة عددية 0.9 ووحدة تحكم المحور XY و Z لاكتشاف إشارة SHG من العظام.

للعثور على سطح العجل ، حدد موقعا مهما مثل التقاطع بين الغرز السهمية والخيوط الإكليلية ، واحصل على صورة. ضع علامة على إحداثيات XY و Z للمعلم ثم استمر في البحث عن موقع الإصابة باستخدام إشارات SHG والفلورسنت كأدلة. عندما يتم العثور على كل منطقة ذات أهمية ، احصل على صورة لأفضل مستوى بؤري يحتوي على إشارات SHG والفلورسنت من الخلايا ذات الأهمية.

احفظ إحداثيات XY و Z والمسافة إلى تقاطع الغرز السهمية والإكليلية لتحديد موقعها الدقيق للجولة التالية من التصوير. ثم لجمع 3D الخلايا والهياكل العظمية لإصابة الكسر. سجل الصور في ما يقرب من اثنين إلى خمسة ميكرون Z مكدس بعمق حوالي 100 ميكرون من سطح العظم الداخلي.

أخيرا ، بعد التصوير ، استخدم كلا موقعي الإصابة قطرات متعددة من محلول ملحي معقم لإزالة هلام ميثيل السليلوز بنسبة 2٪ من الجمجمة. الآن قم بتغطية السطح بالمضادات الحيوية وقم بتغطية الجمجمة باللوحات الجلدية ، وأعد إغلاق فروة الرأس بخيط خياطة مضاد للحساسية واحتفظ بالحيوان في غرفة تعافي دافئة حتى يستعيد وعيه الكافي. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام ، كرر خطوات التصوير داخل الحياة لتتبع التغير الخلوي أثناء التئام الكسر.

في هذه التجربة التمثيلية ، تم إنشاء كسرين دقيقين على العظام الأمامية للجينات MX واحدة أوستيوكالسين الطماطم ، وفئران GFP بعد التشعيع واستبدال نخاع العظام أظهر التصوير الحيوي ثلاثي الأبعاد المتسلسل للكسور الدقيقة نقل الخلايا الجذعية العظمية الإيجابية للطماطم والخلايا السلفية داخل موقع الكسر في اليوم الثاني ، بالإضافة إلى توسعها في اليوم الخامس. على الرغم من عدم اكتشاف بانيات العظم الإيجابية ل GFP في هذا الوقت ، في اليوم 12 ، بدأت مجموعة فرعية من أسلاف العظم بالقرب من سطح الكسر في تمايز بانيات العظم الإيجابية للطماطم GFP كما هو موضح في السهم ، يشير تراكم بانيات العظم الجديدة وتكوين العظام الجديدة في اليوم 21 إلى أن هجرة وتكاثر الخلايا السلفية العظمية كانت آلية رئيسية لتزويد بانيات العظم الجديدة لشفاء الكسر. لاختبار ما إذا كانت هذه الطريقة توفر ناتجا متسقا وكميا لأعداد سلف العظم أثناء التئام الكسر ، تم تتبع MX one YFP الجذعية العظمية والخلايا السلفية الإيجابية لمدة 14 يوما بعد الإصابة.

تم اكتشاف أعداد صغيرة من الأسلاف باستمرار في موقع الإصابة لمدة ثلاثة أيام. زادت أعداد الخلايا باستمرار في اليوم السابع ، لتصل إلى ذروة عدد السكان في اليوم العاشر والتي استمرت في 14 يوما. تم قياس حركية توليد أسلاف العظم عن طريق قياس شدة إشارة YFP بمرور الوقت ، وربطها بتلك التي لوحظت بواسطة الفحص المجهري الحيوي الداخلي.

لوحظ الأسلاف لأول مرة في اليوم الثالث ، وبلغت ذروتها في اليوم العاشر ، وظلت في كثافة عالية مماثلة حتى اليوم 14. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تقنيات الخياطة الماهرة والحد الأدنى من النزيف يمكن أن تقلل من تكوين الندبات وتقلل من التألق الذاتي في الخلفية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير وتتبع انتشار الهجرة وتمايز الخلايا الجذعية السلفية العظمية الذاتية في عملية إصلاح الكسر.