excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices في المختبر نموذج من السكتة الدماغية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق التحفيز السام للخلايا على شرائح الدماغ الدقيقة لإنشاء نموذج السكتة الدماغية في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير شرائح صغيرة أولا من دماغ معزول حديثا. الخطوة الثانية هي موازنة الشرائح الصغيرة بتحريض لطيف.

بمجرد التوازن ، تكون الشرائح الدقيقة جاهزة لتلقي مجموعة متنوعة من التلاعبات التجريبية. في النهاية ، تظهر النتائج أن الشرائح الدقيقة قابلة للحياة لمدة ساعتين على الأقل بعد التجديد. الميزة الرئيسية لتقنيتنا على التقنيات الأخرى الموجودة ، مثل الثقافات الجنينية الأولية والعصبية ، هي أن تقنيتنا تستخدم شرائح من أنسجة المخ الناضجة ، والتي تحتوي على أكثر من نوع واحد من الخلايا ، وبالتالي فهي أكثر تمثيلا لأنسجة المخ السليمة.

الخطوة الأولى هي الحصول على أنسجة دماغية جديدة. اغمس الدماغ في كمية صغيرة من عازلة كريبس الدافئة. لإزالة أي جلد متبقي أو فراء أو دم ، قم بإعداد مفرمة ماكلي وين مع ورقتين من ورق الترشيح المبللة بمحلول كريبس الدافئ.

عندما تصبح جاهزا ، ضع الدماغ على مسرح المروحية. حافظ على رطوبة الدماغ وورق الترشيح باستخدام مخزن مؤقت دافئ أثناء العمل لمنع الدماغ من الانزلاق. تجنب السماح بتراكم الكثير من السوائل على السطح.

قم بتقطيع الدماغ إلى أقسام إكليلية بحجم 250 ميكرومتر. بعد ذلك ، اقلب المسرح 90 درجة وقم بإنشاء شرائح سهمية 250 ميكرومتر. بعد هذه الخطوة ، يشار إلى أقسام الدماغ باسم الشرائح الدقيقة.

ضع الشرائح الصغيرة في قاع دائري مع 10 إلى 15 مل من المخزن المؤقت الدافئ. حرك الأنبوب برفق حتى يتم تعليق الشرائح الدقيقة الفردية ، ثم اتركها تستقر تحت الجاذبية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، والتي ستكون غائمة بسبب حطام الخلية المعلقة ، وأضف 10 مل من المخزن المؤقت الدافئ الطازج إلى الأنبوب.

كرر إجراء الغسيل أربع مرات لإزالة غالبية الحطام بمجرد غسله جيدا. قم بموازنة الشرائح الدقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز اللطيف أو الانعكاس ، وقم بتغيير مخزن كريبس المؤقت كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة في المجموع. بعد هذا الوقت ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت الطازج 37 درجة مئوية كريبس وانقل 15 إلى 20 شريحة صغيرة إلى أنبوب بوليسترين مسطح القاع خمسة ملليلتر.

باستخدام طرف ماصة عريض للغاية مع حواف ناعمة، انشر الشرائح الدقيقة بالتساوي على قاعدة الأنبوب في طبقة واحدة بحيث لا تبعد كل شريحة صغيرة عن بضعة ملليمترات من الغلاف الجوي المؤكسج. بمجرد ترتيبها بشكل صحيح ، احتضن الشرائح الدقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية لتوفير الأكسجين المناسب للشرائح الدقيقة. قم بتمرير الكربوجين باستمرار فوق تعليق شريحة الميكروس مع وضع خط الغاز فوق السطح مباشرة لتجنب الاضطراب الميكانيكي للشرائح الدقيقة للتلامس المباشر مع الغاز للحصول على أفضل النتائج.

من الأهمية بمكان أن يتم تهوية شرائح الميكروس بشكل صحيح. من المهم أن يتم وضع خط الغاز على مسافة مناسبة بعيدا عن سطح نظام التعليق المجهري. يمكن دمج عدة خطوط معا للسماح بحدوث تحفيزات متعددة.

في الوقت نفسه ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المحفزات. في هذا المثال ، تخضع الشرائح الدقيقة لتحفيز AMPA. عالج الشرائح الدقيقة بمحفز سام للخلايا أو عازلة كريبس وحدها.

للتحكم في المجموعة المحفزة. قم بإزالة محلول الحضانة في أوقات مختلفة بعد التحفيز واستبدله ب 300 ميكرولتر من محلول التجانس المثلج البارد في النقطة الزمنية المطلوبة. بعد التحفيز ، قم بتجانس الشرائح الدقيقة على الجليد باستخدام الخالط الزجاجي من التفلون لأسفل ، وتخزين المتجانس عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لمزيد من التحليل.

تظهر معدلات التنفس أن الشرائح الدقيقة التي تم جمعها من الدماغ الأمامي للدجاج قابلة للحياة لمدة تصل إلى ساعتين بعد الإنشاء. تعتبر مستويات A TP المرتفعة ومستويات A DP المنخفضة الموجودة في الشرائح الدقيقة من سمات الخلايا القابلة للحياة. في هذا المثال ، تم قياس محتوى البوتاسيوم في الأنسجة ووجد أنه أعلى الخلفية مباشرة بعد التشريح ، ولكن لزيادة عند الحضانة باستخدام عازلة كريبس ، تسببت إضافة WABE و EGTA في انخفاض محتوى البوتاسيوم في الأنسجة مما يدل على أن الشرائح الدقيقة عادة ما تضخ البوتاسيوم بنشاط وأن المستويات لا ترجع إلى البوتاسيوم المحاصر في الأنسجة الميتة أو الفراغات الخلالية.

هنا تم إنشاء شرائح صغيرة من المخطط والقشرة الحسية لذكور الفئران وإزالة الاستقطاب باستخدام محلول كربس عالي البوتاسيوم. تباين معدل فسفرة الغراء N two B بين القشرة والمخطط ، في حين أن معدل الفسفرة اللاصقة A كان متشابها بين المنطقتين. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.