التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصميم البروتينات المؤتلفة المؤتلفة التي يمكن دمجها في مجموعة متنوعة من التطبيقات مثل المجسات وأجهزة الاستشعار وتوصيل الأدوية وهندسة الأنسجة بنجاح والتعبير عنها وعزلها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحويل البلازميد المصمم خصيصا أولا إلى خط خلية مضيفة بكتيرية باستخدام مزارع صغيرة الحجم ، ثم تحفيز التعبير عن البروتين المستهدف. بعد ذلك ، يتم تحديد وجود البروتين المستهدف وقابليته للذوبان من أجل صياغة إجراءات التنقية المناسبة.

ثم يتم توسيع نطاق الإجراء لإنتاج عوائد أكبر من البروتين المستهدف ، والتي يتم عزلها بعد ذلك باستخدام تقنيات كروماتوغرافيا التقارب. أخيرا ، يتم تنقية البروتينات ثم تركيزها للتطبيقات والتحليلات النهائية. في النهاية ، تتحقق صفحة SDS ونتائج FPLC من أن البروتينات المؤتلفة قد تم عزلها وتنقيتها بنجاح ، ويتم اختبار البروتينات بشكل أكبر من أجل الوظائف.

الميزة الرئيسية لهندسة البروتين المؤتلف هي أنها تسمح لنا بإنشاء كميات كبيرة الحجم أو مليغرام من البروتينات المصممة خصيصا لتلبية مواصفاتنا العلمية الدقيقة. على سبيل المثال ، يمكننا إضافة وظائف جديدة إلى أجزاء من هذه البروتينات لتمكين خصائص جديدة. سنوضح لك اليوم كيف يمكنك البيوتين في نهايات بروتينات معينة ، ونستخدم هذا لتثبيت أو ربط هذه البروتينات على وجه التحديد بالأسطح لتوجيه الوظائف الخلوية مثل نمو الخلايا العصبية أو التمايز العصبي.

يجب ألا يواجه الأفراد الجدد في هذه التقنية صعوبة كبيرة عند اتباع إجراءات عزل البروتين الأصلي أو غير الأصلي. العديد من الخطوات متشابهة ، ولكنها تتطلب عازما محددا تم صياغته للظروف الأصلية أو غير الأصلية. الاهتمام الدقيق بالتفاصيل خلال البداية.

ستضمن مراحل التحويل والتعبير عن الاختبار إنتاجية عالية من البروتين خلال عملية التوسع النهائية اللاحقة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مهما لأنه يوضح كيف يمكن صنع البروتينات المؤتلفة باستخدام معدات ومستلزمات مختبرية بسيطة. باستخدام تفاعل الدفعات البسيط ، يتم زراعة وسائط المعادلة والنمو على نطاق القائد ، وتنتج 10 ملليغرام من البروتين لكل ثقافة رئيسية.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تقنيات الكروماتوغرافيا وإظهارها لإظهار كيفية تنقية البروتينات بشكل أكبر للتطبيق النهائي اليوم ، ستعرض أليسيا ، خريجة مختبر السينما الإجراء بعد الاستنساخ واختبار التعبير في البروتين المستهدف محل الاهتمام ، وتنمية ثقافة 20 مليلتر بين عشية وضحاها. وفقا لبروتوكول النص ، اسكب المزرعة الليلية في 1.8 لتر من وسط النمو المعقم مع الأمبيسلين واستخدم ماصة الباستير لإضافة ست إلى ثماني قطرات من العقمة المضادة للرغوة 2 0 4 مكان المزارع في حمام مائي 37 درجة مئوية من خلال مرشح 0.2 ميكرون ، فقاعة الهواء المضغوط في الثقافات من خلال أحجار التهوية. عندما تصل المزرعة إلى OD 600 من 0.7 إلى 0.8 عند IPTG مليمولي واحد وتحفزها لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها عند 18 درجة مئوية ، اعتمادا على ما إذا كان البروتين قد تم العثور عليه في الجزء القابل للذوبان أو غير القابل للذوبان في تعبير الاختبار.

تجارب لجمع الخلايا ، ونقل المزرعة إلى زجاجات طرد مركزي سعة لتر واحد ، وتدويرها لمدة 15 دقيقة عند 14،000 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية. اسكب السوبر ناتين وباستخدام ملعقة رفيعة ، اغرف الحبيبات البكتيرية في أنبوبين سعة 50 مل. حبيبات الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي لبضع دقائق قبل تخزين الكريات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لأداء البروتين غير الأصلي. عزل البروتين غير القابل للذوبان لكل حبيبات الإشريكية القولونية المجمدة. أضف 20 مل من التحلل ، وغسل المخزن المؤقت ، والدوامة ورجها لإعادة التعليق للتخلص من أي قطع كبيرة.

بعد الحضانة على مطفر طوال الليل ، سيبدو المحلول وكأنه جهاز طرد مركزي لزج. الملاط عند 20 ، 500 مرة من الجاذبية ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات لعزل البروتين الأصلي.

Resus بتعليق الكريات في مخزن التحلل بحجم نهائي يبلغ 30 مل مع الحبيبات المعلقة على الجليد. اضبط الصوتنة على سعة 30٪ مع نبضة 30 ثانية على 30 ثانية ، وصوتنة لمدة خمس دقائق. تمايل الأنبوب لأعلى ولأسفل أثناء الصوتنة لتفكيك بيليه الخلية تماما.

الطرد المركزي الملاط عند 20 ، 500 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. لإجراء كروماتوغرافيا التقارب على بروتين معزول غير أصلي ، أضف ملليلترا واحدا من محلول راتنج NTA من النيكل إلى كل أنبوب طرد مركزي واحتضانه على مطفر أو شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.

صب الملاط في عمود تقارب والسماح للمحلول بالتنقيط من خلال صمام الديك الحابس تماما في دورق النفايات. أضف 10 ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى أنبوب الطرد المركزي لإزالة الراتنج المتبقي وإضافة المحلول إلى العمود بعد تساقط المحلول. استخدم قضيب تقليب زجاجي لتقليب الراتنج واتركه ينتهي من التنقيط قبل إضافة غسول آخر.

بعد ذلك ، استخدم 10 مل من عازلة الغسيل لتكرار شطف أنبوب الطرد المركزي ونقله إلى العمود. ثم قم بإجراء ثماني غسلات أخرى للعمود مع 10 مل من محلول غسيل التحلل لكل غسلة. بعد اكتمال الغسيلات ، أغلق قضيب التوقف واستبدل دورق النفايات بأنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل.

أضف 15 مل من المخزن المؤقت elucian إلى العمود ، وحرك الراتنج واترك المحلول لمدة خمس دقائق. ثم افتح قضيب التوقف واجمع EIT قبل التكرار باستخدام 15 مل إضافية من المخزن المؤقت للشطف لتنقية البروتين الأصلي. بعد إضافة راتنج النيكل NTA إلى محلول البروتين ، يتم تحضينها على مطفر عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد استخدام عازلة الغسيل لغسل العمود 10 مرات ، أضف خمسة ملليلتر من عازلة الشطف واحتضان الراتنج لمدة خمس دقائق قبل استخدام أنبوب جديد لجمع معظم EIT أثناء تساقط EIT من العمود ، أضف 90 ميكرولترا لكل بئر من كاشف برادفورد إلى لوحة بئر شفافة 96. بعد كل خمسة ملليلتر من المحلول مع المخزن المؤقت ، اترك 10 ميكرولترات من المحلول بالتنقيط من العمود إلى بئر يحتوي على 90 ميكرولترا من كاشف برادفورد. استمر في استخدام EEU حتى لا يتم اكتشاف البروتين لغسيل الكلى و / أو رينا.

تنقل البروتينات كل EIT إلى أنبوب غسيل الكلى وتتحلل كالة مقابل المخزن المؤقت المناسب ، واحدة لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية قبل استبدالها بالمخزن المؤقت المعني. اثنان بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. استخدم مكثفات الدوران لتركيز البروتينات التي تم تحللها إلى أقل من خمسة ملليلتر وتنقيتها بشكل أكبر باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم إذا رغبت في ذلك من قبل atin eight.

وفقا لبروتوكول النص أثناء التعبير التجريبي ، تم تحفيز NGF و SE three A لأول مرة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية وحدد تحليل صفحة SDS أن كلا البروتينين كانا موجودين في هذا الجزء القابل للذوبان. بدا تعبير البروتين عادلا ، وبالتالي تم فحص تعبير اختبار آخر مع الحث بين عشية وضحاها عند 18 درجة مئوية. تحسن تعبير NGF في الجزء القابل للذوبان ، بينما لم يكن هناك فرق ملحوظ مع SEMA ثلاثة.

تم عزل NGF في ظل ظروف أصلية وغير أصلية وتم تشغيله عبر عمود FPLC للتنقية. على الرغم من أن NGF كان في الجزء القابل للذوبان أثناء التعبير عن الاختبار ، إلا أن العزلة الأصلية أنتجت عائدا منخفضا عند كل من الحث 37 درجة مئوية و 18 درجة مئوية. ومع ذلك ، تم الحصول على عائد أعلى من NGF من خلال العزل غير الأصلي مع إعادة التسوية.

نتيجة لذلك ، تم عزل NGF في ظل ظروف غير أصلية. بعد الحث الليلي عند 18 درجة مئوية ، أدى العزل غير الأصلي إلى عدم إنتاج SEMA ثلاثة مع 8.61 زائد أو ناقص 3.1 ملليغرام لكل ثقافة رئيسية من لترين للعزل الأصلي. لذلك ، تم تحفيز SEMA three A لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية وتم عزلها باستخدام معلمات العزل الأصلية.

تم جمع قمم FPLC وتم تحليل عينات NGF و SEMA ثلاثة A باستخدام صفحة SDS. تم جمع قمم البروتين الإضافية الموجودة في إخراج FPLC ل SEMA ثلاثة A وتحليلها باستخدام صفحة SDS ولم تكن موجودة في SEMA ثلاثة منطقة الوزن الجزيئي. من المرجح أن تكون هذه الكسور منتجات تحلل لأنها لم تتصرف وظيفيا في المقايسات القائمة على الخلايا ، كما فعلت SEMA الثلاثة.

الذروة المشار إليها هنا. بمجرد إنشائها وإتقانها ، يجب أن يستغرق العزل والتنقية بضعة أيام فقط إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ومع ذلك ، فإن مراحل التحول الأولي للبكتيريا واختبار التعبير يستغرق وقتا أطول من أجل تحديد قابلية ذوبان البروتين بشكل صحيح.

بمجرد تحديد الذوبان ، يمكن تخزين مكتبة البكتيريا المحولة في سالب 80. بالإضافة إلى ذلك ، بعد التعبير عن البروتين ، يمكن تخزين كريات الإشريكية القولونية في درجة حرارة 80 تحت الصفر أيضا حتى مزيد من العزلة والتجريب. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من تعقيم المخازن المؤقتة وجعلها طازجة لمنع البروتياز من تغيير طبيعة البروتينات وتكسيرها.

يجب عمل مخازن عزل وتعقيمها كل أربعة إلى ستة أسابيع ، ويجب عمل مخازن غسيل الكلى في اليوم السابق للعزل. يجب أن تكون أعمدة N-I-N-T-A و FPLC نظيفة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة من أجل منع التلوث المتبادل من البروتينات الحيوية المتعددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات الحيوية المصممة خصيصا وعزلها وتنقيتها باستخدام نظام تعبير المضيف البكتيري.

هذا مشابه لما يتم علميا وتجاريا على نطاق صغير وكبير. وبالتالي ، فإن هذا له تطبيق واسع.