التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء التصوير والتحليل لعملية الانقسام الفتِيلي للخلايا السلفية العصبية في شرائح حية من دماغ الفأر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الدماغ من الأجنة، ثم تتمثل الخطوة الثانية في تحضير شرائح الدماغ باستخدام جهاز التقطيع الاهتزازي (vibratome).

بعد ذلك، يتم إجراء التصوير الحي لشرائح الدماغ. وتتمثل الخطوة النهائية في استخراج المعلومات من المقاطع المصورة لتحليل بارامترات الانقسام الفتيلي ذات الصلة. وفي الختام، يُستخدم المجهر المعتمد على التصوير المتقطع بالزمن (time-lapse microscopy) لإظهار كيفية انقسام المجموعات السليفة في الدماغ في الوقت الفعلي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التحليل الثابت، في إمكانية اكتساب رؤى عميقة حول الديناميكيات الزمنية لانقسام السلائف العصبية في شرائح الدماغ الحية. كما يمكن استخدامها لفهم كيفية تأثير الاضطرابات الجينية على انقسام السلائف العصبية. ورغم أننا نستخدم هذه الطريقة لفهم تطور القشرة المخية، إلا أن التحليل الذي وصفناه يمكن تطبيقه على دراسة الانقسام المتساوي للخلايا الجذعية في مناطق أخرى من الدماغ أو حتى خارج الدماغ.

سيقوم لويس y، وهو زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري، بشرح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بجمع أجنة الفئران وتشريح الأدمغة الجنينية، بما في ذلك الدماغ الخلفي والأدمغة الأربعة مع نصفي الكرة المخية. في دلو من الثلج، اصنع فتحة في الثلج لوضع قوالب التضمين.

بعد ذلك، صب وسط aros بتركيز 3% في قالب بلاستيكي وضع هذا القالب في الفتحة الموجودة في الثلج. قم بتحريك وسط aros باستخدام طرف ميزان حرارة رقمي حتى تصل درجة الحرارة إلى 35 درجة مئوية. ثم انقل الدماغ على الفور إلى وسط التضمين لإزالة أي HBSS زائد عند السطح الفاصل بين الدماغ وaros.

قم بتدوير الدماغ بعناية وببطء وبشكل متكرر في محلول التضمين. باستخدام الملقط، ستتكون وسادة من الأجار المتجمد في قاع القالب عند ملامسته للثلج. بمجرد الشعور بالوسادة باستخدام طرف الملقط أثناء تحريك الدماغ، قم بوضع الدماغ بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى، مع مراعاة ألا يغرق الدماغ إلى قاع القالب تماماً.

اترك القوالب (aros) تتصلب في الثلج لمدة خمس دقائق على الأقل قبل قص زوايا القالب باستخدام شفرة حلاقة. قم بنحت كتلة القالب بدقة حول الدماغ وحاول تقليل عدد القطعات لتجنب إزعاج الدماغ المغمور. باستخدام جهاز VT 1000 s Viome، قم بتوليد شرائح يتراوح سمكها بين 200 و 250 micron.

قم الآن بتخفيف cyto 11 ليصل إلى تركيز نهائي يتراوح من 0.5 إلى 1 µM في وسط زراعة الشرائح المدعم بعوامل النمو، وفي طبق يحتوي على 12 بئرًا، يتم تحضين شرائح من دماغ واحد في 2.5 mL من محلول الصبغ في كل بئر لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. بعد ذلك، تُغسل الشرائح في 2.5 mL من وسط زراعة الشرائح الخالي من محلول الصبغ لمدة 20 دقيقة. ولتثبيت مقاطع الدماغ، ضع قطرة من محلول الكولاجين في قاع طبق ميكروويل زجاجي القاع بقطر 35 mm.

قم بتوزيعه باستخدام رأس ماصة ليتناسب مع حجم الشريحة. ثم انقل الشريحة إلى قطرة من الكولاجين. اترك الشرائح لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل نقلها إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 degree Celsius مع 5%carbon dioxide.

بعد 20 دقيقة، أضف إجمالي 1.2 milliliters من وسط زراعة الشرائح إلى طبق الآبار الزجاجي القاع، بمقدار 600 microliters من الوسط في كل مرة، ووزعه باستخدام طرف الماصة. اترك الشرائح لتتعافى في الحاضنة لمدة ساعة و30 دقيقة على الأقل عند 37 °C مع 5% carbon dioxide قبل نقلها إلى غرفة التحضين في مجهر confocal ذو القرص الدوار بنفس الظروف. وبالنسبة للتصوير الحي، استخدم عدسة شيئية من زيت السيليكون بقوة 60 x وبمسافة عمل تبلغ 300 microns وفتحة عددية تبلغ 1.3.

بالنسبة لتصوير الخلايا، يتم تصوير الخلايا في مجموعة Z stack بسمك 30 ميكرون، مع وضع مركز الـ Z stack على عمق 40 ميكرون تقريبًا تحت سطح الشريحة. إذا لزم الأمر، يتم ضبط قوة الليزر وأوقات التعرض للحد من التبييض الضوئي، واستخدام وقت تعرض يتراوح من 30 إلى 200 مللي ثانية اعتمادًا على شدة إشارة cyto 11. فيما يلي بيانات تمثيلية يمكن الحصول عليها من هذا التحليل لتحديد الأشكال الانقسامية في برنامج image J. بعد فتح مجموعة البيانات لموضع واحد كـ hyper stack، اختر مستوى Z واحدًا تبدو فيه الأنسجة والخلايا سليمة.

قم بالتمرير رجوعاً في الزمن لتحديد النقطة الزمنية التي تدخل فيها الخلية في مرحلة الانقسام الفتيلي. قد تتحرك الخلية عبر مستويات Z، ولكن الدقة الزمنية ومعلمات Zack المذكورة سابقاً قد تم تحسينها لتمكين هذه العملية. قم بتسجيل إحداثيات D الأربعة للخلية في المكدس الفائق (hyper stack) عند دخولها في الانقسام الفتيلي في جدول بيانات.

من شأن معرفة هذه الإحداثيات أن تمنع عد الخلية نفسها عدة مرات. قم بالتمرير للأمام في الزمن وسجّل الوقت الذي تنتقل فيه الخلية من طور إلى آخر. وثّق مدة كل طور من أطوار الانقسام الفتيلي لخلية معينة لإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا وقياس كمية الدوران خلال الطور الاستوائي.

بعد تحديد عدة خلايا في طور الانقسام الفتيلى، استخدم إحداثيات إحدى الخلايا وقم بالتمرير زمنياً للأمام حتى بداية طور الاستواء (Metaphase)، ثم قم بتدوير الـ hyper stack بالكامل بحيث يصبح الحد البطيني أكثر استواءً. استخدم أداة قياس الزاوية لتحديد الزاوية التي سيتم تطبيقها لهذا التدوير.

حدد المستوى Z الذي تكون فيه الخلية المستهدفة أكثر وضوحاً في ذلك المستوى. استخدم أداة تحديد المستطيل لرسم تحديد يشمل الخلية بأكملها. ثم حدد مستويات Z التي تتضمن الخلية المستهدفة واستخدم أمر تكرار الصورة (image duplicate) لإنشاء مجموعة فرعية (sub stack).

في مربع الحوار، اترك خيار duplicate hyper stack محدداً للمقاطع (slices). يتوافق المعامل Z مع المستويات Z، بما في ذلك الخلية بأكملها والإطارات، بينما يتوافق المعامل T مع النقطة الزمنية الحالية. بعد ذلك، قم بإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (3D reconstruction) للخلية.

عند النقطة الزمنية الحالية. تمثل المسافة بين المقاطع الفاصل الزمني بين كل صورة من صور المستوى Z بالميكرونات. باستخدام شريط التمرير، قم بتدوير إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الناتجة بحيث تكون حافة الصفيحة الاستوائية مرئية.

يتوافق رقم الإطار مع زاوية بيتا. سجل هذا الرقم. ثم قم بقياس الزاوية بين الخط الأفقي ومحاذاة bys.

تشريح الصفيحة الاستوائية بشكل عمودي. هذا هو سجل الزاوية alpha. هذه الزوايا لجميع النقاط الزمنية للمرحلة الاستوائية للخلية المعنية.

تساوي زاوية الدوران بين النقطتين الزمنيتين t و t ناقص واحد القيمة المطلقة للفرق بين الزاوية عند t وهذه الزاوية عند T ناقص واحد على طول المحور الظهري البطني. يتم تصوير الانقسام الميتوزي بسهولة أكبر في المناطق الظهرية من شرائح الدماغ لأن الاستطالة القاعدية لـ R GCs تكون أقصر وبالتالي تكون أقل عرضة للقطع بواسطة المقطع العرضي. وعلى طول محور ROS coddle، تعطي الشرائح في مناطق coddle من القشرة الظهرية النتائج الأكثر اتساقاً.

هذه أمثلة لمنطقة جيدة ومنطقة سيئة للتصوير. في المنطقة الجيدة، تكون النوى بيضاوية الشكل ويُلاحظ وجود العديد من الخلايا الانقسامية عند حدود البطين قبل التصوير بفاصل زمني، أما في المنطقة السيئة، فيُلاحظ وجود عدد قليل جداً من الخلايا الانقسامية عند حدود البطين وتكون النوى مستديرة.

فيما يلي مثال لشريحة جيدة تمت ملاحظتها باستخدام مجهر ذو تكبير منخفض قبل التصوير الحي، وهنا بعض الأمثلة لخلايا مُعلمة بـ cyto 11 في مراحل مختلفة من الانقسام الفتيلى. يظهر هنا تجميع لمجموعة من الصور لمنطقة عند حدود البطين حيث تمر خليتان من السلائف العصبية بمراحل مختلفة من الانقسام الفتيلى مُميزة بألوان مختلفة بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل التثقيب الكهربائي المحايد لبنيات DNA، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، بما في ذلك ما هو مصير الخلايا المنقسمة وكيف يتصرف الهيكل الخلوي؟

يُفضل أيضاً استخدام طرق ثانوية بالإضافة إلى CY 11 لمتابعة الانقسام الفتيلي، مثل الفئران المعدلة وراثياً H two VGFP. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية التعامل مع شرائح الدماغ، وما هي معاملات المطابقة الأفضل، وكيفية تحليل البيانات.