التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تصوير وتحليل الانقسام العصبي في شرائح دماغ الفأر الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الأدمغة أولا من الأجنة. الخطوة الثانية هي تحضير شرائح الدماغ مع اهتزاز.

بعد ذلك ، يتم إجراء التصوير المباشر لشرائح الدماغ. الخطوة الأخيرة هي استخراج المعلومات من الأفلام لتحليل معلمات الانقسام الفتيلي ذات الأهمية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني لإظهار كيفية انقسام مجموعات أسلاف الدماغ في الوقت الفعلي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التحليل الثابت ، هي أنه يمكن للمرء أن يكتسب نظرة ثاقبة حول الديناميكيات الزمنية لانقسام السلف العصبي في شرائح الدماغ الحية. يمكن استخدامه أيضا لفهم كيف يمكن أن تؤثر الاضطرابات الجينية على انقسام السلف العصبي. على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة لفهم التطور القشري ، إلا أن التحليل الذي وصفناه يمكن تطبيقه على دراسة الانقسام الفتيلي للخلايا الجذعية في مناطق الدماغ الأخرى أو حتى خارج الدماغ.

سيظهر هذا الإجراء لويس واي ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بجمع أجنة الفئران وتشريح الأدمغة الجنينية ، بما في ذلك الأدمغة الخلفية والأدمغة الأربعة ذات نصفي الكرة الدماغية. في دلو من الثلج ، قم بإنشاء ثقب في الجليد لقوالب التضمين.

بعد ذلك ، صب 3٪ وسط أروس في قالب بلاستيكي وضع هذا القالب في الفتحة الموجودة في الجليد. قلب وسط aros بطرف مقياس حرارة رقمي حتى تصل درجة الحرارة إلى 35 درجة مئوية. ثم انقل الدماغ على الفور إلى وسط التضمين لإزالة HBSS الزائد في الواجهة بين الدماغ والأروس.

قم بتدوير الدماغ بعناية وبرفق بشكل متكرر في محلول التضمين. باستخدام الملقط ، ستتشكل وسادة من الهلام في قاع القالب عند ملامستها للجليد. بمجرد أن يتم الشعور بالوسادة بطرف الملقط أثناء تحريك الدماغ ، وضع الدماغ مع الجانب الظهري لأعلى ، يجب ألا يغرق الدماغ في قاع القالب.

دع الحروس يتماسك في الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل قبل قطع زوايا القالب بشفرة حلاقة. نحت بعناية كتلة aros حول الدماغ وحاول تقليل عدد الجروح لتجنب إزعاج الدماغ المضمن. مع VT 1000 s Viome تولد 200 إلى 250 ميكرون شريحة.

الآن قم بتخفيف cyto 11 إلى تركيز نهائي من 0.5 إلى ميكرومولار واحد في وسط زراعة الشرائح المكمل بعوامل النمو و12 لوحة بئر تحتضن شرائح من دماغ واحد في 2.5 مل من محلول التلوين في كل بئر لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل الشرائح في 2.5 مل من وسط زراعة الشرائح دون تلطيخ المحلول لمدة 20 دقيقة. لتركيب أقسام الدماغ ، ضع قطرة من محلول الكولاجين في قاع طبق ميكروويل زجاجي قاع 35 ملم.

انشرها برأس ماصة لتتناسب مع حجم الشريحة. ثم انقل شريحة إلى قطرة من الكولاجين. دع الشرائح تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل نقلها إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 20 دقيقة بإجمالي 1.2 مل من وسط استزراع الشرائح في الجزء الزجاجي الصغير ، طبق جيدا 600 ميكرولتر من الوسط في المرة الواحدة ونشره بطرف ماصة. دع الشرائح تتعافى في الحاضنة لمدة ساعة و 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل نقلها إلى غرفة حضانة المجهر متحد البؤر للقرص الدوار بنفس الظروف. بالنسبة للتصوير المباشر ، استخدم هدف زيت السيليكون 60 × بمسافة عمل 300 ميكرون وفتحة عددية 1.3.

بالنسبة لصورة تصوير الخلية ، توجد الخلايا الموجودة في كومة Z 30 ميكرون مع مركز المكدس Z ، على بعد حوالي 40 ميكرون تحت سطح الشريحة. إذا لزم الأمر ، اضبط طاقة الليزر وأوقات التعرض للحد من التبييض الضوئي واستخدم وقت التعرض الذي يتراوح من 30 إلى 200 مللي ثانية اعتمادا على شدة إشارة cyto 11. فيما يلي بيانات تمثيلية يمكن للمرء تحقيقها من هذا التحليل لتحديد الأشكال الانقسامية في الصورة J.بعد فتح مجموعة البيانات لموضع واحد كمكدس فائق ، حدد مستوى Z واحد حيث تبدو الأنسجة والخلايا سليمة.

قم بالتمرير بالزمن إلى الوراء لتحديد النقطة الزمنية التي تدخل فيها الخلية في الانقسام. قد تتحرك الخلية عبر مستويات Z ، ولكن تم تحسين الدقة الزمنية ومعلمات Zack الموضحة سابقا لتمكين هذه العملية. في جدول بيانات، سجل الإحداثيات D الأربعة للخلية في المكدس المفرط عند دخولها الانقسام.

معرفة هذه الإحداثيات ستمنع عد نفس الخلية عدة مرات. قم بالتمرير للأمام في الوقت المناسب وسجل الوقت الذي تتقدم فيه الخلية من مرحلة إلى أخرى. قم بتوثيق مدة كل مرحلة انقسامية لخلية معينة لإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا وتحديد كمية الدوران أثناء الطور.

بعد تحديد العديد من الخلايا الانقسامية ، استخدم إحداثيات الخلية وقم بالتمرير للأمام في الوقت المناسب حتى البداية. تقوم الطور بتدوير المكدس المفرط بالكامل بحيث يكون الحد البطيني مسويا. استخدم أداة الزاوية لتحديد الزاوية للتقدم لهذا الدوران.

حدد المستوى Z حيث تكون الخلية محل الاهتمام هي الأكثر وضوحا في هذا المستوى. استخدم أداة تحديد المستطيل لرسم تحديد يتضمن الخلية بأكملها. ثم حدد مستويات Z التي تتضمن الخلية محل الاهتمام واستخدم الأمر image duplicate لإنشاء مكدس فرعي.

في مربع الحوار، اترك المكدس المفرط المكرر محددا للشرائح. تتوافق المعلمة Z مع مستويات Z ، بما في ذلك الخلية بأكملها والإطارات التي تتوافق المعلمة T مع النقطة الزمنية الحالية. بعد ذلك ، قم بإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلية.

في الوقت الحالي. يتوافق تباعد الشرائح مع الفاصل الزمني بين كل صورة من صور المستوى Z بالميكرون. باستخدام شريط التمرير ، قم بتدوير إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الناتجة بحيث تكون حافة لوحة الطور مرئية.

يتوافق عدد الإطار مع زاوية بيتا. سجل هذا الرقم. ثم قم بقياس الزاوية بين الأفقي والمحاذاة بواسطة.

تشريح لوحة الطور بشكل عمودي. هذا هو السجل ألفا للزاوية. هذه الزوايا لجميع النقاط الزمنية للطور الطوري للخلية محل الاهتمام.

زاوية الدوران بين النقطتين الزمنيتين t وt ناقص واحد تساوي القيمة المطلقة للفرق بين الزاوية عند t وهذه الزاوية عند T ناقص واحد على طول المحور البطني الظهري. يمكن تصوير الانقسام بسهولة في المناطق الظهرية لشرائح الدماغ لأن العملية القاعدية ل R GCs أقصر وبالتالي تقل احتمالية قطعها بواسطة فيوم. على طول الشرائح التي تقلب محور ROS في مناطق القشرة الظهرية تعطي النتائج الأكثر اتساقا.

هذه أمثلة على منطقة جيدة ومنطقة سيئة للتصوير. في منطقة جيدة. يتم تشكيل النوى بشكل بيضاوي الشكل ويتم ملاحظة العديد من الخلايا الانقسامية عند حدود البطين قبل التصوير بفاصل زمني في منطقة سيئة ، ويلاحظ عدد قليل جدا من الخلايا الانقسامية على حدود البطين والنوى مستديرة.

فيما يلي مثال على شريحة جيدة لوحظت بمجهر تكبير منخفض قبل التصوير الحي ، وإليك بعض الأمثلة على الخلايا المصنفة cyto 11 في مراحل مختلفة من الانقسام. يظهر هنا مونتاج لمنطقة على حدود البطين حيث يمر سلفان عصبيان بمراحل مختلفة من الانقسام الفتيلي بألوان مختلفة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التثقيب الكهربائي المحايد لتركيبات الحمض النووي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، بما في ذلك مصير الخلايا المنقسمة وكيف يتصرف الهيكل الخلوي؟

من الأفضل أيضا استخدام طرق ثانوية تتجاوز CY 11 لمتابعة الانقسام مثل H اثنين من الفئران المعدلة وراثيا VGFP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة شرائح الدماغ ، وما هي أفضل معلمات المطابقة ، وكيفية تحليل البيانات.