تقنيات الحقن المجهري في أسماك الزيبرا

يتيح الحقن المجهري لأجنة zebrafish للباحثين إيصال المحاليل مباشرة إلى الحيوان النامي، وذلك لدراسة وظيفة الجينات وديناميكيات النمو. وغالباً ما تُستخدم الأجنة في مرحلة 1 إلى 4 خلايا لعملية الحقن. ونظراً لعدم وجود أغشية تفصل بين الخلايا والمح (yolk) في هذه المرحلة المبكرة، فإن المحاليل المحقونة سواء في خلية واحدة أو في المح ستنتشر بالتساوي في جميع أنحاء الكائن الحي. ومن خلال استخدام الحقن المجهري، يمكن التعبير عن الجينات المسؤولة عن إنتاج البروتين، أو إيقاف عملها، وذلك اعتماداً على نوع المادة المحقونة. سيوضح هذا الفيديو كيفية تحضير الماصة، وجمع الأجنة، وإجراءات الحقن المجهري، كما سيناقش بعض الطرق التي تُستخدم بها هذه التقنية في المختبرات اليوم.

أولاً، دعونا نستعرض المكونات الرئيسية لنظام الحقن المجهري: المجهر التشريحي (Stereoscope)، وجهاز الحقن المجهري، وحامل الماصة، والمناور المجهري (Micromanipulator).

يقوم جهاز الحقن المجهري بضخ حجم دقيق من خلال نبضات ضغط هوائية يمكن للمستخدم ضبطها. ويقوم حامل الماصة بتثبيت الماصة لاستخدامها أثناء العملية وربطها بخط الهواء الخاص بجهاز الحقن. وعادةً ما يُوضع حامل الماصة داخل المناور المجهري، حيث تتيح هذه الأداة للباحث إجراء تعديلات صغيرة ودقيقة على موقع الماصة أثناء عملية الحقن. كما يتم توصيل دواسة قدم بجهاز الحقن لتمكين الباحث من استخدام يديه مع تفعيل نبضة الضغط في الوقت ذاته لإيصال مادة الحقن. وأخيراً، يتيح المجهر التشريحي للباحث رؤية الأجنة والتركيز على موقع الماصة أثناء عملية الحقن المجهري.

قبل البدء في عملية الحقن المجهري، يجب تحضير الإبر الزجاجية. ويجب أن تكون إبر الحقن المجهري ذات حجم ثابت للسماح بتوصيل دقيق لمواد الحقن. يساعد جهاز سحب الماصات (pipette puller) في ضمان تحضير ماصات دقيقة وحادة في كل مرة؛ حيث يقوم الجهاز بتسخين أنبوب شعري زجاجي مع تسليط قوة سحب على الأنبوب، مما ينتج عنه إبرتان للماصة.

باستخدام المجهر وملقط، يتم قطع الطرف بطريقة تسمح بتوصيل حجم ثابت من السائل، مع الحفاظ في الوقت ذاته على حدة الإبرة لاختراق جنين سمكة الزيبرا (zebrafish embryo).

يمكن خلط اللون الأحمر الفينولي (Phenol red)، وهو صبغ يُستخدم للمساعدة في رؤية عملية الحقن، مع محلول الحقن من أجل تتبع نجاح عملية الحقن في الجنين.

يمكن تعبئة الإبر بمحلول الحقن من جهة الطرف عبر الخاصية الشعرية، أو يمكن تعبئتها من الخلف باستخدام حقنة تعبئة مجهرية (microloader syringe). وبمجرد تعبئة الإبرة للحقن، يمكن إدخالها في حامل الماصة الموجود على الملاعب المجهري (micromanipulator).

بعد تجهيز إبر الحقن، يتم ضبط إعدادات الضغط والوقت في الجهاز الحقن المجهري لمعايرة كل إبرة، مما يضمن توصيل حجم ثابت لكل جنين. وباستخدام المجهر التشريحي (stereoscope)، يتم حقن كمية صغيرة من المحلول في قطرة من الزيت المعدني على شريحة زجاجية. يتم قياس حجم القطرة وبناءً عليه يمكن حساب الحجم الذي تفرغه الإبرة. لاحقاً، يمكن ضبط ضغط الجهاز الحقن المجهري بشكل أدق وتكرار العملية حتى يتم الحصول بانتظام على قطرة بالحجم المطلوب.

بمجرد تحضير الإبر ومعايرتها، يتم الحصول على الأجنة وتجهيزها للحقن.

يجب وضع الأجنة بعناية وتثبيتها في مكانها أثناء الحقن باستخدام غرفة حقن مجهري. ولإنشاء غرفة الحقن المجهري، توضع القوالب في طبق بتري، ثم يُصب الأجاروز المصهور في الطبق ويُترك ليتصلب. وبمجرد تجمده، تتم إزالة القالب ثم يُصب الوسط الجنيني فوقه. يمكن رص الأجنة في الأخاديد التي شكلها القالب باستخدام ماصة نقل. وهناك بديل لترتيب الأجنة في الأجاروز وهو رصها على طول حافة شريحة مجهرية، بحيث يتم وضعها في عمود مخصص للحقن المجهري

بمجرد استقرارها في موضعها، تصبح الأجنة جاهزة للحقن.

يمكن حقن الأجنة إما في المح، أو في سيتوبلازم الخلية. يعد الحقن في المح أبسط ويتطلب تقنية حقن أقل تعقيداً، بينما يعد الحقن في السيتوبلازم أكثر صعوبة، ولكنه يعطي نتائج أكثر دقة وقوة. وللحقن في المح، استخدم الميكرومناور (micromanipulator) لتحريك الإبرة بحيث تخترق الغشاء الكوريوني (chorion) ثم المح. بعد ذلك، يتم الضغط على الدواسة لتفريغ محتويات الإبرة في المح. ويسمح التدفق السيتوبلازمي والانتشار لمحلول الحقن بالتدفق إلى داخل الخلية.

يتطلب الحقن في السيتوبلازم تحديد موضع الجنين بدقة، بحيث يمكن استهداف السيتوبلازم بفعالية.

بعد الحقن، تُنقل الأجنة إلى طبق جديد وتُحضن عند درجة حرارة 28.5 °C. ويتم فحصها بشكل متكرر لإزالة الأجنة الميتة.

ولتحديد مدى نجاح عملية الحقن، يمكن تحليل الأجنة بناءً على مظهرها العام، ووجود علامة فلورية، ومن خلال البحث عن تغيرات في جينومها باستخدام التنميط الجيني (genotyping).

بعد أن أصبحت تدرك كيفية حقن أجنة أسماك الزيبرفيش، دعنا نلقِ نظرة على كيفية استخدام العلماء لهذه التقنية لفهم وظائف الجينات.

أولاً، يمكن للعلماء حقن mRNA مُصنّع للإفراط في تعبير جينات معينة وتحديد وظيفتها من خلال ملاحظة النمط الظاهري. كما يمكن استخدام هذه التقنية ذاتها للتعبير عن بروتينات تسلط الضوء على الأحداث الجزيئية، مثل إعادة ترتيب الهيكل الخلوي التي تحدث أثناء النمو.

ثانياً، يمكن إيقاف عمل الجينات عن طريق حقن المورفولينوهات. والمورفولينوهات هي نظائر حمض نووي اصطناعية مستقرة يمكن تصميمها للارتباط بتسلسلات mRNA محددة عن طريق الاقتران القاعدي القياسي للأحماض النووية، مما يؤدي إلى منع عملية الترجمة. وهذا يؤدي بدوره إلى فقدان البروتين الذي ينتجه mRNA المذكور. ويسمح هذا التأثير للباحثين بفهم دور جين معين في النمو من خلال رؤية كيف يتغير النمو في حالة غيابه.

يمكن استخدام الحقن لإدخال DNA غريب إلى أسماك الزيبرفيش. فمن خلال حقن تسلسلات تحتوي على مواقع التعرف للإنزيمات المعدلة للـ DNA، يستطيع العلماء توليد أسماك "معدلة وراثياً" بكفاءة ذات جينومات معدلة، مما يعني أن الجينات الغريبة ستنتقل إلى الأجيال القادمة. وبناءً على تصميم التسلسل، يمكن حصر التعبير الجيني في أنسجة محددة أو نقاط زمنية محددة من مرحلة النمو.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول الحقن المجهري لأجنة سمك الزيبرا في مراحلها المبكرة. استعرض هذا الفيديو تجهيزات الحقن المجهري، ووضح كيفية تحضير إبر الحقن المجهري، وكيفية تحضير الأجنة للحقن، وتنفيذ تقنية الحقن المجهري، بالإضافة إلى بعض تطبيقات هذه التقنية. وكما هو الحال دائماً، شكراً للمشاهدة!