الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

في البروتوكول التالي ، سيتم توضيح قياس ملامح الطاقة الحيوية واستجابات الانفجار التأكسدي للخلايا الوحيدة في الدم البشري والخلايا الليمفاوية والعدلات والصفائح الدموية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الطبقة المصقولة وأجزاء البلازما الغنية بالصفائح الدموية أولا من الدم المسحوب حديثا. كخطوة ثانية ، يتم فصل خلايا الدم البيضاء غير المتجانسة إلى طبقات خلايا أحادية النواة ومتعددة الأشكال بواسطة تدرج الكثافة.

بعد ذلك ، يتم عزل مجموعات العدلات والخلايا الليمفاوية الوحيدة النقية عن طريق الفصل الأقصى ثم يتم طلاؤها لتحليل التدفق خارج الخلية أو XF. في النهاية ، يمكن قياس القياس الحساس والقابل للتكرار لوظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية والصفائح الدموية ، بالإضافة إلى الانفجار التأكسدي لمعدلات استهلاك الأكسجين أحادي الخلايا والعدلات بواسطة تقنية XF. ميزة التقنية التي سنعرضها لكم اليوم هي أنه يمكنك تحضير جميع الخلايا الرئيسية الموجودة في دم المريض من عينة دم صغيرة.

هذه هي الصفائح الدموية والكريات البيض في شكل نقي معطل وقياس وظيفة الميتوكوندريا. نعتقد أن هذا يمكن أن يعكس أمراضا وحالات مختلفة داخل المريض في الوقت الفعلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتمثيل الغذائي ، مثل دور نمط الحياة والنظام الغذائي والإجهاد المرضي على وظيفة الميتوكوندريا.

يجمع هذا البروتوكول بين تقنيات متعددة لعزل وتحديد الطاقة الحيوية الخلوية في مجموعات مختلفة من الكريات البيض وفي الصفائح الدموية. هذه الخطوة من البروتوكول مهمة للغاية لأن تدرج الكثافة والفصل المغناطيسي يتطلبان ماصة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون على دراية بمكان وجود مجموعات الخلايا أثناء التجزئة.

سنوضح عزل خلايا الدم المحيطية وتحليل الطاقة الحيوية الخلوية على محلل التدفق خارج الخلية 24 بئرا أو XF 24. ومع ذلك ، يمكن أيضا تنفيذ هذه الطريقة على XF 96 ، قبل ساعتين على الأقل من بدء الإجراء. قم بترطيب مجسات خرطوشة مستشعر XF باستخدام محلول الكرن XF.

ثم قم بتدوير الدم الكامل المسحب حديثا لمدة 15 دقيقة عند 500 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي باستخدام دوار دلو متأرجح. استخدم ماصة نقل لإزالة الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما الغنية بالصفائح الدموية حتى يبقى سنتيمترا واحدا من البلازما فوق طبقة طبقة كريات الدم الحمراء ووضع البلازما جانبا في درجة حرارة الغرفة لمعالجتها لاحقا. ثم انقل طبقة بافي إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر وقم بتخفيف خلايا الدم البيضاء إلى 24 ملليلترا.

مع RPMI القاعدية بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من الكثافة المنخفضة ، 1.077 غير شفاف لكل من ثلاثة أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلترا. ثم ضع طرف ماصة ضيقة سعة خمسة ملليلتر في قاع كل أنبوب. في المقابل وإطلاق ببطء ثلاثة ملليلتر من الكثافة العالية ، له غير شفاف 1.119.

الآن ، استخدم ماصة آلية على إعداد الطاقة المنخفضة لإضافة ثمانية ملليلتر من الدم المخفف بعناية إلى كل تدرج دون إزعاج الطبقات. تمت إضافة الصبغة الزرقاء إلى التدرج منخفض الكثافة لتصور جميع طبقات التدرج. بعد فصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي بشكل منفصل ، اجمع الخلايا أحادية النواة ومتعددة الأشكال باستخدام ماصات زجاجية معقمة دون إزعاج نطاقات الخلايا الأخرى.

قم بتجميع مجموعات الخلايا أحادية النواة ومتعددة الأشكال من كل أنبوب في أنابيب مخروطية واحدة معقمة سعة 50 مليلتر لكل نوع من أنواع الخلايا ، وأضف أربعة أحجام من RPMI إلى كلا الأنبوبين. بعد الدوران لأسفل ، تنقل الخلايا الكريات إلى أنبوب 1.5 مليلتر ، تعيد الحبيبات وتعيد تعليقها في 80 ميكرولتر من RPMI الطازج المكملة ب BSA. ثم أضف 20 ميكرولترا من الخرزة المغناطيسية المسماة الأجسام المضادة المضادة ل CD 14 و CD 15 إلى كسور الخلايا أحادية النواة ومتعددة الأشكال على التوالي.

احتضان كل معلق خلية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم اغسل كل أنبوب بمليلتر واحد من وسائط R-P-M-I-B-S-A وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من R-P-M-I-B-S-A. ثم قم بتطبيق معلقات الخلية على أعمدة LS المغسولة الفردية R-P-M-I-B-S-A واغسل كل عمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من وسائط R-P-M-I-B-S-A اجمع تدفق تعليق الخلية وغسل العمود في أنابيب معقمة لعزل الخلايا الوحيدة والعدلات ، وقم بإزالة الأعمدة من المجال المغناطيسي بعد الغسيل النهائي وقم بإزالة الخلايا المختارة إيجابيا في أنبوب معقم بخمسة ملليلتر من R-P-M-I-B-S-A. لعزل الخلايا الليمفاوية ، قم بتحبيب التدفق عبر جزء الغسيل من عمود الخلية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 80 ميكرولتر من R-P-M-I-B-S-A ، واحتضان الخلايا في 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD 61 و CD 2 35 A لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

ثم كرر الفصل الأقصى كما كان من قبل ، واجمع التدفق من خلال احتواء الخلايا الليمفاوية لعزل الصفائح الدموية ، وأجهزة الطرد المركزي ، والبلازما الغنية بالصفائح الدموية المحجوزة ، ثم قم بإزالة البلازما وغسل حبيبات الخلية مرة واحدة بخمسة ملليلتر من PBS المعقم المكمل بميكروغرام واحد لكل مليلتر من البروستاجلاندين الأول ، قم بإعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية في مليلتر واحد من PBS prostaglandin I اثنين من العازلة لصفيحة الخلايا الوحيدة المعزولة ، الخلايا الليمفاوية والعدلات والصفائح الدموية. قم أولا بحساب الخلايا وإحضارها إلى حجم مناسب في وسط فحص XF للسماح بكثافة بذر 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في حجم 200 ميكرولتر. في صفيحة مجهرية لثقافة الخلية 24 بئر XF مطلية بالخلية T لبذور الصفائح الدموية 2.5 مرة 10 إلى الخلايا السبع لكل بئر في حجم 200 ميكرولتر.

بعد تدوير الخلايا على اللوحة ، قم بإحضار أحجام البئر النهائية حتى 660 ميكرولتر باستخدام وسائط XF واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل اختبار XF أثناء حمل الحضانة ، 75 ميكرولترا من كواشف الفحص بالترتيب المدرج في منافذ حقن خرطوشة مستشعر XF. إذا كان سيتم الحصول على قياسات الانفجار التأكسدي ، فيمكن حقن PMA بعد مضاد الميسين ، وهو منفذ الحقن التالي الذي يتم تحميل الخرطوشة على محلل التدفق خارج الخلية لبدء الفحص. يمكن تحديد ملامح الطاقة الحيوية للكريات البيض والصفائح الدموية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية لفرس البحر XF ، والذي يقيس استهلاك الأكسجين في الوقت الفعلي في الخلايا بشكل غير جراحي.

يتم طلاء كل نوع من أنواع الخلايا على صفيحة XF 24 الدقيقة بخمس نسخ مكررة كما هو موضح للتو في الجدول. يتم توضيح قيم الانفجار القاعدية والتأكسدية التمثيلية كما تم قياسها أثناء الفحص ومتوسط تركيزات البروتين لكل بئر حسب نوع الخلية ، ويتم تطبيع قيم معدل استهلاك الأكسجين إلى إجمالي محتوى البروتين في الآبار المقابلة ويتم التعبير عنها ب p moles في الدقيقة لكل ميكروغرام من البروتين. ثم يتم تحديد معدل استهلاك الأكسجين القاعدي من خلال القياسات الثلاثة الأولى.

يتم حقن Oligo mycin ، وهو مثبط للميتوكوندريا A TP synthase في وسط XF لتقدير معدل استهلاك الأكسجين المقترن بتخليق TP ويتم تمثيله على أنه TP مرتبط بمعدل استهلاك الأكسجين المتبقي مطروحا منه معدل استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا يمكن أن يعزى إلى تسرب البروتون. تسمح إضافة FCCP غير المقترن بتحديد الحد الأقصى لمعدل استهلاك الأكسجين ، يليه حقن antimycin a ومثبط لتنفس الميتوكوندريا لقياس المصادر غير الميتوكوندريا لاستهلاك الأكسجين. السعة الاحتياطية هي مقياس لمقدار العمل الإضافي الذي يمكن أن تؤديه الميتوكوندريا في ظل زيادة الطلب على الطاقة ويمكن حسابها على أنها الفرق بين الحد الأقصى لمعدل التنفس والقاعدي من أجل تحديد قدرة الانفجار التأكسدي للخلايا الوحيدة والعدلات.

يتم حقن ناهض P-M-A-P-K-C وترتبط الزيادة في معدل استهلاك الأكسجين بإنتاج المؤكسد بواسطة N-A-D-P-H oxidase بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ثلاث ساعات بعد جمع الدم ، ولا تشمل الفحص نفسه إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة عن طريق تنفيذ كل خطوة في خزانة السلامة البيولوجية واستخدام مخازن ووسائط معقمة لدرجة حرارة الغرفة. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا عمل بروتوكولات أخرى ، مثل تحليل الفاكس لتحديد نقاء الخلايا ، وحالة تنشيط الكريات البيض ، وكذلك لتحديد الطاقة الحيوية الخلوية في مجموعات الكريات البيض الفرعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فكرة واضحة إلى حد ما عن كيفية تحضير الصفائح الدموية والخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والعدلات ، ووضعها في فرس البحر وقياس الانفجار التأكسدي ووظيفة الميتوكوندريا من هذه البيانات. ثم يمكنك تحليل مجموعات مرضاك وتحديد كيفية تغير الطاقة الحيوية الخاصة بهم في الوقت الفعلي. لا تنس أن العمل مع عينات من المرضى البشريين يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

لذلك ، تحتاج إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية وكذلك استخدام خزانة السلامة البيولوجية أثناء هذا الإجراء.