قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات الطولية في الخصائص الميكانيكية للمصفوفة خارج الخلية في نماذج السرطان ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الخلايا السرطانية أولا وزراعة الستيرويد الورم بطريقة مناسبة حتى تصل إلى الحجم المطلوب. الخطوة الثانية هي تضمين الستيرويد الورمي في الكولاجين أو أي مصفوفة أخرى مناسبة خارج الخلية.

بعد ذلك ، يتم إنشاء شبكة نقاط العينة ويتم التقاط مقطع فيديو في كل نقطة. الخطوة الأخيرة هي تحليل بيانات الفيديو وحساب الخصائص المنطقية الحقيقية وتسجيلها المشترك في كل نقطة مكانية. في النهاية ، يستخدم هذا البروتوكول تحليل مسارات مسبار التتبع لتحديد التغيرات المكانية طوليا في ميكانيكا المصفوفة خارج الخلية بطريقة غير مدمرة.

الفكرة هي أنه من خلال الجمع بين القياسات القائمة على التصوير لأشعة المصفوفة خارج الخلية مع نماذج الورم ثلاثية الأبعاد في المختبر ، والتي تستعيد تفاعلات المصفوفة خارج الخلية ، يمكن أن يوفر هذا النهج نظرة ثاقبة كمية للتغيرات المعتمدة على الوقت في البيئة المكروية الميكانيكية التي تصاحب عمليات غزو نمو الورم والاستجابة للعلاج. تتبنى الطريقة الموضحة في هذا الفيديو نهج تراكب aros لتوليد OIDs ثلاثية الأبعاد غير ملتصقة من خط خلايا سرطان البنكرياس الراسخ. للبدء ، امزج 10 مل من ماء زراعة الخلايا مع 0.1 جرام من aros للحصول على محلول 1٪ aros.

سخني محلول الحروس إلى أعلى من 70 درجة مئوية قبل علي. نقلا عن 40 ميكرولترا من المحلول في كل بئر من صفيحة 96 بئر ، احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، وحصاد الخلايا السرطانية عبر التربسين وقم بإعداد معلق خلية واحدة قبل تخفيف تعليق الخلية إلى 1000 خلية لكل مليلتر. أضف 100 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى البئر الذي يحتوي على سرير أروس المعالج.

ضع العينة على شاكر طوال الليل في حاضنة مثبتة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد الحضانة. قم بإزالة العينة من شاكر وأضف 100 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا ، واستمر في احتضان الستيرويد الناتج حتى يتم الوصول إلى القطر المطلوب. على سبيل المثال, بعد تسعة أيام, مقلاة, الستيرويد واحد سيكون حوالي 450 ميكرون في القطر.

للبدء ، قم بإعداد محطة عمل داخل غطاء تدفق رقائقي مع قارورتين ملليلترتين. ستحتوي القارورة الأولى على الستيرويد الورمي وستكون القارورة الثانية قابلة للتحكم في الخلايا. قم بإعداد خليط مخفف من مجسات تتبع الفلورسنت المعدلة بالكربوكسيل بقطر ميكرون واحد عن طريق إضافة جزأين من مجسات المخزون إلى 25 جزءا من الماء المعقم.

قم بإزالة زجاجة من 3.1 ملليغرام لكل ملليلتر ، كولاجين بقري من الثلاجة وضعها على الثلج 125 ميكرولتر من الكولاجين ، متبوعا ب 50 ميكرولترا من محلول مسبار التتبع المخفف في قارورة واحدة دوامة لفترة وجيزة لتوزيع المجسات. ثم أضف 235 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا المناسبة التي تحتوي على الفينول الأحمر بحجم إجمالي يبلغ 410 ميكرولتر والدوامة لفترة وجيزة قبل إزالة 205 ميكرولتر ووضعها في قارورة اثنتين. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من ميكرولترين من هيدروكسيد الصوديوم المولي إلى القارورة.

واحد لإعادة المحلول إلى دوامة الأس الهيدروجيني المحايدة لفترة وجيزة للخلط. ثم ارجع إلى رف الثلج على الفور حتى لا يبدأ الخليط في المعالجة. قم بإزالة 40 ميكرولتر من الوسائط برفق من البئر الذي يحتوي على الستيرويد الورمي.

احتفظ بهذا 40 ميكرولتر أثناء إجراء الخطوة التالية. تحقق من البئر لمعرفة ما إذا كان قد تمت إزالة الستيرويد في الخطوة السابقة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، ضع 40 ميكرولترا مرة أخرى في البئر وكرر الخطوة السابقة.

إذا كان الأمر كذلك ، أضف 40 ميكرولتر تحتوي على الستيرويد إلى قارورة. قارورة واحدة تقلب برفق قبل نقل الخليط في 60 أجزاء ميكرولتر إلى ثلاثة آبار منفصلة من 96 لوحة بئر ، افحص كل بئر بالمجهر بعد إضافة الخليط لتحديد البئر الذي يحتوي على الستيرويد. ثم أضف ما يقرب من ميكرولترين من هيدروكسيد الصوديوم المولي و 40 ميكرولترا من وسائط زراعة الخلايا إلى قارورة اثنتين ودوامة قبل علي.

نقلا عن 60 ميكرولترا من هذا الخليط في بئر فارغ في صفيحة البئر 96 ووصفها بأنها عنصر تحكم خال من الخلايا. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية للعلاج لمدة ساعة واحدة على الأقل لبناء شبكة من نقاط العينة. أولا ، انقل لوحة العينة من الحاضنة إلى مرحلة المجهر.

اترك 10 دقائق حتى تتوازن العينة مع درجة حرارة الغرفة في حالة عدم توفر مرحلة ساخنة. راقب العينة بعدسات موضوعية منخفضة الطاقة للتأكد من أنها سليمة وجاهزة للتصوير. حدد موضع الورم داخل البئر وتوثيق ذلك باستخدام صورة ضوئية مرسلة للتسجيل المشترك المكاني اللاحق.

عادة ما تنتج 20 نقطة عينة في كل بئر موزعة في حلقات متحدة المركز حول الكروي S نتائج مفصلة بشكل كاف. انقل المرحلة إلى كل موضع مطلوب واستخدم برنامج التفاعل المجهري لتسجيل إحداثيات XNY. قم بتبديل المجهر إلى عدسة موضوعية عالية الطاقة وحدد مكعب المرشح المناسب للطول الموجي x للاقتباس لمجسات التتبع.

باستخدام قائمة النقاط التي تم إنشاؤها، انتقل إلى النقطة الأولى في الشبكة. اضبط التركيز للعثور على قاع البئر قبل التحرك لأعلى. للعثور على مجال رؤية يحتوي على العديد من مجسات تتبع التركيز البؤري.

راقب الرسم البياني للشدة واضبط شدة التعريض الضوئي والوقت لإعطاء أكبر نطاق ديناميكي ممكن مع التأكد من عدم تشبع الصورة. احصل على تسلسل فيديو بمعدل إطارات يتراوح من 20 إلى 30 مللي ثانية لكل إطار وحفظه باستخدام اصطلاح تسمية مناسب. أثناء التسجيل ، لا تلمس المجهر أو الطاولة.

كرر التسجيل لكل نقطة عينة في الشبكة. ثم تابع تكرار العملية لإنشاء شبكة لكل بئر في التجربة وكرر العملية بأكملها في كل مرة. أشر على مدى مدة المراقبة الطولية.

لبدء تحليل البيانات. انسخ جميع بيانات الفيديو إلى مجلد تحليل. استيراد بيانات الصورة إلى MATLAB أو برنامج تحليل آخر.

بمعايرة البرنامج عن طريق تحليل عدة إطارات من الفيديو لتحديد معلمات الاختيار والرفض بشكل مناسب لتحديد مواضع مركز المسبار. ثم استخدم البرنامج لتحديد كل موضع مسبار تلقائيا لجميع إطارات الفيديو ، ثم ربط هذه المواضع في المسارات. استخدم بيانات المسار لحساب متوسط الإزاحة المربعة أو MSD كدالة لوقت التأخر مع التأكد من تطبيق عامل المعايرة المكانية المناسب للعدسة الموضوعية المحددة أو لأي بكسل للبكسل.

احسب G Star باستخدام علاقة ستوكس أينشتاين المعممة ، مع الأخذ في الاعتبار حدود قابلية تطبيق علاقة ستوكس أينشتاين المعممة لعينة معينة. كرر خطوات التحليل لكل مجال من مجالات الرؤية في التجربة. سجل بيانات الموضع باستخدام mod اللزج المرن I بتردد معين من الاهتمام ، اعتمادا على الشركة المصنعة للمجهر المستخدم.

يمكن تسهيل هذه الخطوة من خلال روتين مخصص ، والذي يقرأ البيانات الوصفية المجهرية أو بيانات الموضع التي يمكن جدولتها يدويا. يتم الحصول على تسلسلات الفيديو في مواقع مكانية متعددة داخل بئر تمثيلي يحتوي على عقيدة ورم ثلاثية الأبعاد وربطها لتوفير خريطة أشعة دقيقة مكانية للعينة عند مراقبة مجموعات الخلايا طوليا في محيط المقلاة. سوف تتحلل المنشطات المستخدمة في هذا المثال تلقائيا ألياف الكولاجين المحيطة وتغزو المصفوفة خارج الخلية في غضون أيام قليلة.

في هذا المثال ، يوفر التسجيل المشترك للعلم الجزئي قراءة كمية للغزو الواضح في المصفوفة التي تحدث إلى اليسار ، ولكن ليس على يمين الستيرويد. ويظهر الرصد الطولي لهذه المناطق المكانية المتباينة انخفاضا في المكون الحقيقي لمعامل القص اللزج المرن المعقد بحوالي أربعة أوامر من حيث الحجم مصاحبة للغزو. يتم عرض البيانات المعتمدة على التردد الكامل متناقضة في الخصائص اللاهوتية للمادة في المنطقة الأولى والمنطقة الثانية في اليوم الرابع.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب توخي الحذر لتجنب المزالق الشائعة أثناء تحليل مسارات المسبار التي تؤدي إلى استنتاجات غير مناسبة. نحن نشجع القراء على الرجوع إلى أدبيات PTM المذكورة هنا ، والتي تتناول اعتبارات مثل انحراف العينة وتفسير عدم التجانس. يمكن دمج هذا الإجراء مع التصوير الفلوري الطولي أو الطرفي الإضافي للإجابة على أسئلة أخرى ، مثل كيفية ارتباط إعادة التصميم الميكانيكي بأحداث الإشارات الرئيسية أو الاستجابة السامة للخلايا للتدخل.