قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات الطولية في الخصائص الميكانيكية للمصفوفة خارج الخلوية في نماذج السرطان ثلاثية الأبعاد. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد الخلايا السرطانية وتنمية الكرويات الورمية باستخدام طريقة مناسبة حتى تصل إلى الحجم المطلوب. وتتمثل الخطوة الثانية في غمر الكروية الورمية في الكولاجين أو أي مصفوفة خارج خلوية أخرى مناسبة.

بعد ذلك، يتم إنشاء شبكة من نقاط العينات وتسجيل مقطع فيديو عند كل نقطة. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل بيانات الفيديو وحساب الخصائص المنطقية الحقيقية وإعادة تسجيلها في كل نقطة مكانية. وفي نهاية المطاف، يستخدم هذا البروتوكول تحليل مسارات المسبار المتتبع لقياس التغيرات المكانية في ميكانيكا المصفوفة خارج الخلوية طولياً وبطريقة غير إتلافية.

تتمثل الفكرة في أنه من خلال الجمع بين القياسات القائمة على التصوير الشعاعي للمصفوفة خارج الخلية ونماذج الأورام ثلاثية الأبعاد في المختبر، والتي تستعيد التفاعلات مع المصفوفة خارج الخلية، يمكن لهذا النهج أن يوفر رؤية كمية للتغيرات المعتمدة على الوقت في البيئة المجهرية الميكانيكية التي تصاحب عمليات نمو الورم وغزوه، والاستجابة للعلاج. تعتمد الطريقة الموضحة في هذا الفيديو نهج تراكب aros لإنتاج عضوانيات (OIDs) ثلاثية الأبعاد غير ملتصقة من خط خلايا سرطان البنكرياس المعتمد pan one. للبدء، اخلط 10 milliliters من الماء المخصص لزراعة الخلايا مع 0.1 gram من aros للحصول على محلول aros بتركيز 1%.

قم بتسخين محلول aros إلى درجة حرارة أعلى من 70 °C قبل الإضافة. قم بتوزيع 40 µL من المحلول في كل بئر من أطباق معايرة ذات 96 بئراً، ثم احضن الطبق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة، واجمع الخلايا السرطانية باستخدام trypsin وقم بإعداد معلق من الخلايا المفردة قبل تخفيف معلق الخلايا إلى 1000 خلية لكل mL. أضف 100 µL من هذا التخفيف إلى البئر الذي يحتوي على طبقة aros المتصلبة.

ضع العينة على هزاز طوال الليل في حاضنة مضبوطة عند 37 درجة مئوية و5%CO2 بعد عملية التحضين. أخرج العينة من الهزاز وأضف 100 µL من وسط زراعة الخلايا، ثم باشر بتحضين العضواني الناتج حتى يصل إلى القطر المطلوب. على سبيل المثال، بعد تسعة أيام، سيكون قطر العضواني الواحد حوالي 450 microns تقريباً.

للبدء، قم بتجهيز محطة عمل داخل غطاء تدفق صفائحي مع أنبوبين سعة 2 mL. سيحتوي الأنبوب الأول على الستيرويد الورمي، بينما سيكون الأنبوب الثاني عبارة عن ضابط خالٍ من الخلايا. قم بتحضير خليط مخفف من مجسات التتبع الفلورية بقطر 1 micron المعدلة بالكربوكسيلات عن طريق إضافة جزأين من المجسات الأصلية إلى 25 جزءاً من الماء المعقم.

أخرج زجاجة من الكولاجين البقري بتركيز 3.1 milligrams per milliliter من الثلاجة وضعها على الثلج، ثم انقل 125 microliters من الكولاجين، يليها 50 microliters من محلول مسبار التتبع المخفف إلى الأنبوب الأول، واستخدم جهاز المزيج الدوامي (vortex) لفترة وجيزة لتوزيع المسبارات. بعد ذلك، أضف 235 microliters من وسط زراعة الخلايا المناسب الذي يحتوي على الفينول الأحمر ليصل الحجم الإجمالي إلى 410 microliters، وامزجه بدوامة قصيرة قبل سحب 205 microliters ونقلها إلى الأنبوب الثاني. أخيراً، أضف حوالي two microliters من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز one molar إلى الأنبوب.

لإعادة المحلول إلى pH متعادل، استخدم جهاز الـ vortex لفترة وجيزة للمزج. ثم أعده إلى حامل الثلج فوراً حتى لا يبدأ الخليط في التصلب. اسحب بلطف 40 µL من الوسط من البئر الذي يحتوي على الستيرويد الورمي.

احتفظ بهذا الحجم البالغ 40 µL أثناء تنفيذ الخطوة التالية. افحص البئر للتأكد من إزالة الستيرويد في الخطوة السابقة. وإذا لم يتم ذلك، أعد الـ 40 µL إلى البئر وكرر الخطوة السابقة.

إذا كان الأمر كذلك، أضف الـ 40 µL التي تحتوي على الستيروئيد إلى القارورة. قم بتحريك القارورة الأولى بلطف قبل نقل الخليط في حصص قدرها 60 µL إلى ثلاث آبار منفصلة في طبق يحتوي على 96 بئرًا، وافحص كل بئر باستخدام المجهر بعد إضافة الخليط لتحديد البئر التي تحتوي على الستيروئيد. بعد ذلك، أضف حوالي 2 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M و 40 µL من وسط زراعة الخلايا إلى القارورة الثانية وقم برجها بجهاز الفورتيكس قبل التوزيع.

يتم توزيع 60 µL من هذا الخليط في بئر فارغ في لوحة ذات 96 بئراً وتسميته كعنصر تحكم خالٍ من الخلايا. توضع اللوحة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل لتكوين شبكة من نقاط العينات. أولاً، يتم نقل لوحة العينات من الحاضنة إلى منصة المجهر.

اترك العينة لمدة 10 دقائق لتتوازن مع درجة حرارة الغرفة في حال عدم توفر منصة تسخين. افحص العينة باستخدام عدسات شيئية ذات قوة تكبير منخفضة للتأكد من سلامتها وجاهزيتها للتصوير. حدد موقع الورم داخل البئر ووثق ذلك بصورة باستخدام الضوء النافذ لغرض التسجيل المكاني المشترك اللاحق.

عادةً ما تؤدي 20 نقطة عينة في كل بئر، موزعة في حلقات مركزية حول الكروي S، إلى الحصول على نتائج مفصلة بشكل كافٍ. حرك المنصة إلى كل موضع مطلوب واستخدم برنامج واجهة المجهر لتسجيل إحداثيات XNY. قم بتحويل المجهر إلى عدسة شيئية ذات قوة تكبير عالية واختر مكعب المرشح المناسب لطول موجة الاستثارة الخاص بمجسات التتبع.

باستخدام قائمة النقاط التي تم إنشاؤها، انتقل إلى النقطة الأولى في الشبكة. اضبط التركيز للعثور على قاع البئر قبل التحرك للأعلى، وذلك للعثور على مجال رؤية يحتوي على عدة مجسات تتبع في نطاق التركيز.

راقب المدرج التكراري لكثافة الإضاءة وقم بتعديل كثافة التعريض وزمنه لتحقيق أكبر نطاق ديناميكي ممكن مع ضمان عدم وصول الصورة إلى مرحلة التشبع. سجل تسلسلاً فيديو بمعدل إطارات يتراوح من 20 إلى 30 ملي ثانية لكل إطار، واحفظ الملف باستخدام اصطلاح تسمية مناسب. أثناء التسجيل، تجنب لمس المجهر أو الطاولة.

كرر عملية التسجيل لكل نقطة عينة في الشبكة. ثم انتقل إلى تكرار العملية لإنشاء شبكة لكل بئر في التجربة، وكرر العملية بأكملها لكل نقطة زمنية على مدار فترة المراقبة الطولية.

لبدء تحليل البيانات، انسخ جميع بيانات الفيديو إلى مجلد التحليل. ثم استورد بيانات الصور إلى برنامج MATLAB أو أي برنامج تحليل آخر.

قم بمعايرة البرنامج من خلال تحليل عدة إطارات من الفيديو لتحديد معايير الاختيار والرفض المناسبة لتحديد مواقع مراكز المسبار. بعد ذلك، استخدم البرنامج لتحديد موقع كل مسبار تلقائياً لجميع إطارات الفيديو، ثم اربط هذه المواقع في مسارات. استخدم بيانات المسار لحساب متوسط مربع الإزاحة أو MSD كدالة للزمن الفاصل، مع التأكد من تطبيق عامل المعايرة المكانية المناسب لعدسة الشيئية المحددة أو لأي تجميع للبكسلات (pixel binning).

احسب G Star باستخدام علاقة ستوكس-أينشتاين المعممة، مع مراعاة حدود تطبيق علاقة ستوكس-أينشتاين المعممة لعينة معينة. كرر خطوات التحليل لكل مجال رؤية في التجربة. قم بإجراء التسجيل المشترك لبيانات الموضع مع viscoelastic mod I عند تردد معين محل الاهتمام، وذلك بناءً على الشركة المصنعة للمجهر المستخدم.

يمكن تسهيل هذه الخطوة باستخدام روتين مخصص يقرأ البيانات الوصفية للمجهر، أو يمكن جدولة بيانات الموضع يدويًا. يتم الحصول على تسلسلات الفيديو من عدة مواضع مكانية داخل بئر ممثل يحتوي على عقدة ورمية ثلاثية الأبعاد، ويتم ربطها لتوفير خريطة شعاعية مجهرية مكانية للعينة عند مراقبة مجموعات الخلايا الموجودة في محيط الوعاء طوليًا. ستقوم الخلايا المستخدمة في هذا المثال بتحليل ألياف الكولاجين المحيطة بها تلقائيًا وغزو المصفوفة خارج الخلوية في غضون بضعة أيام.

في هذا المثال، يوفر التسجيل المشترك للمجهرية قراءة كمية للغزو الواضح في المصفوفة الذي يحدث على يسار الستيرويد، وليس على يمينه. ويظهر الرصد الطولي لهذه المناطق المكانية المتباينة انخفاضاً في المكون الحقيقي لمعامل القص اللزوجي المرن المركب بنحو أربعة أوامر مقدارية بالتزامن مع الغزو. وتظهر البيانات الكاملة المعتمدة على التردد تبايناً في الخصائص الريولوجية للمادة في المنطقة الأولى والمنطقة الثانية في اليوم الرابع.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضرورة توخي الحذر لتجنب الأخطاء الشائعة عند تحليل مسارات المسبار والتي قد تؤدي إلى استنتاجات غير دقيقة. ونحن نشجع القراء على الرجوع إلى أدبيات PTM المذكورة هنا، والتي تتناول اعتبارات مثل انزياح العينة وتفسير عدم التجانس. يمكن دمج هذا الإجراء مع تصوير فلوري إضافي، سواء كان طولياً أو نهائياً، للإجابة على تساؤلات أخرى، مثل كيفية ارتباط إعادة التشكيل الميكانيكي بأحداث نقل الإشارات الرئيسية أو الاستجابة السامة للخلايا تجاه تدخل معين.