باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تداخل RNA لدراسة تأثير الجينات المرشحة على الاستجابة المناعية الفطرية. ولتحقيق ذلك في البلاعم الفأرية، يتم هضم خطوط خلايا البلاعم الفأرية باستخدام التربسين ودمجها مع محلول عفن الخلية وsiRNAs المستهدفة، ثم يُنقل المزيج إلى لوحة NucleoFECT ذات 96 بئراً، ويُستخدم نظام Maxa لترصيص 96 بئراً لنقل siRNA إلى البلاعم. وبعد الحضانة في وسط زراعة الخلايا، يتم تعريض البلاعم التي خضعت لعملية عفن الخلية لـ LPS أو منشطات أخرى للمناعة الفطرية لتحفيزها. وأخيراً، يتم إجراء اختبارات ELISA لمراقبة إنتاج السيتوكينات وتقييم تأثير المعالجة بـ siRNA على الاستجابة المناعية الفطرية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالترانسفكشن بوساطة الليبيدات في أن المقايسة الخاصة بنا قوية ويمكن تطبيقها على العديد من الجينات في عملية عالية الإنتاجية. ويكمن مفتاح هذه الطريقة في التعامل مع خلايا سليمة، ومعاملتها بلطف، والعمل بكفاءة خلال عملية الترانسفكشن. وكما سنوضح، يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا البلعام الفأرية RAW 264.7، والتي يتم استزراعها كما هو موضح في المستند المرفق.

كجزء من التحضير لصفيحة ترانسفكشن INA، يتم استزراع الخلايا بكثافة 20% وتترك لتنمو لمدة يوم أو يومين حتى لا تتجاوز كثافة الخلايا 80%. ومن المهم تذكر استخدام خلايا تتراوح ممراتها بين الثالث والعاشر. بعد الإذابة، ابدأ هذا الإجراء ببرمجة نظام مكوك الـ 96 بئرًا الذي سيُستخدم في عملية الترانسفكشن.

للقيام بذلك، قم بتشغيل برنامج مكوك الـ 96 بئراً من قائمة الملفات في الزاوية العلوية اليسرى على الكمبيوتر المتصل بالمكوك. اختر ملف معلمات جديد. حدد الآبار التي سيتم نقل الجينات إليها في المخطط المعروض لصفيحة الـ 96 بئراً.

سيشير مربع أخضر إلى الآبار المحددة. اختر البرنامج الذي يتوافق مع الخط الخلوي للبلاعم المستخدم لخلايا raw 2 64 0.7. اختر DS 1 36 ثم حدد apply.

لاحظ أنه بعد اختيار البرنامج، ستتلون الآبار في المخطط التوضيحي للصفيحة. تشير الدوائر الفارغة ذات اللون الأزرق الداكن إلى الآبار التي لم يتم تخصيص برنامج لها ولن يتم تعريضها للصدمة الكهربائية. بعد ذلك، قم بتحضير محلول المؤثر النووي العامل عن طريق خلط محلول المؤثر النووي لخط خلايا SF في 96 بئرًا مع كامل محتويات أنبوب المكمل المرفق.

اترك الكواشف المخلوطة لتتوازن في درجة حرارة الغرفة. قم بتدفئة D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTA وPBS عند 37 degrees Celsius. قم بتحضير البلازميد الضابط التجريبي S-I-R-N-A-P max GFP أو siRNAs الموصومة فلورياً عن طريق إذابتها على الثلج لفصل البلاعم الملتصقة من أطباق المزرعة الخلوية.

قم بشفط الوسط واغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 milliliters من PBS. بعد ذلك، وبعد إزالة PBS، قم بحضن الخلايا باستخدام 1 milliliter من 0.25%tripsin EDTA المُدفأ مسبقاً لكل طبق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال. تستغرق هذه العملية من دقيقة إلى دقيقتين.

انقر بلطف على الطبق وحرك المحلول أثناء فترة التحضين لزيادة كفاءة عملية التريبسين (trypsinization). بعد انفصال الخلايا، أضف تسعة ملليلترات من خليط DMEM و FBS بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم اجمع الخلايا بنقلها بواسطة الماصة إلى أنبوب معقم. قم بعدد الخلايا البلعمية المعزولة باستخدام مقياس كرات الدم (Hema Cytometer).

يُتوقع وجود ما يقرب من 10 مليون من الخلايا البلعمية لكل طبق بقطر 10 سنتيمتر. احسب العدد الإجمالي للخلايا البلعمية المطلوبة، حيث تتطلب كل بئر في حامل الأطباق ذو الـ 96 بئراً 200,000 خلية. انقل العدد المحسوب من الخلايا بواسطة الماصة إلى أنبوب طرد مركزي.

قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 10 minutes بسرعة 150 G في درجة حرارة الغرفة داخل لوح معقم ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً، وهو ما يسهل عملية الخلط مع تقليل فقدان الكواشف. أضف 2 µL من كل IRNA إلى كل بئر سيتم ترنسفكشينه. لاحظ أنه بناءً على عدد الـ siRNAs، يمكن إتمام هذه الخطوة أثناء مرحلة الطرد المركزي للخلايا البلعمية.

إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو التثقيب الكهربائي، حيث تكمن الركائز الأساسية في التعامل مع الخلايا برفق شديد والعمل بسرعة فائقة. فبمجرد وضع الخلايا في محلول ترانسفكشن سام، يتم سحب الوسط من الخلايا الممركزة بجهاز الطرد المركزي، ثم إعادة تعليقها برفق في محلول nucleo effector SF الذي يحتوي على المحلول المكمل.

انقل الخلايا فوراً إلى حوض معقم باستخدام ماصة متعددة القنوات، ثم انقل 20 microliters من خليط الخلايا المعاد تعليقها إلى كل بئر من آبار طبق 96 بئراً الذي يحتوي على siRNAs، مع المزج بلطف عن طريق السحب والدفع بالماصة. بعد ذلك، انقل 20 microliters من خليط الخلايا INA إلى طبق NucleoVet ذو 96 بئراً. من الضروري تجنب تكوين فقاعات خلال هذه الخطوة لأن ذلك قد يؤدي إلى حدوث أخطاء أثناء عملية التثقيب النووي.

بعد وضع جميع العينات التجريبية في لوحة عفن الخلية (transfection plate)، قم بتغطيتها بالغطاء المرفق وانقر عليها برفق شديد على سطح صلب. ولإزالة أي فقاعات، ضع لوحة الـ 96 بئراً في ناقل الـ nucleo effector ذو الـ 96 بئراً، ومن أسفل يمين شاشة البرنامج، اختر "upload" ثم "start". بعد ذلك، اتبع توجيهات البرنامج لحفظ النتائج أثناء إتمام عملية الـ nucleo affection في الآبار بنجاح.

سيتم تمثيل الخلايا التي خضعت لعملية التعداء (Transfected) في المخطط التوضيحي لطبق الـ 96 بئراً الظاهر على الشاشة بدائرة خضراء تحتوي على علامة زائد. وتشير الدائرة الحمراء التي تحتوي على علامة ناقص إلى وجود خطأ يرجح أن يكون ناتجاً عن فقاعات أو سحب حجم غير صحيح من الكواشف مباشرة بعد عملية التثقيب النووي (nucleo affection). استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 80 µL من وسط RPMI 1640 الدافئ مسبقاً.

أضف الوسط إلى جانب كل بئر، واتركه يمتزج ببطء مع الخلايا المنقولة جينياً، والتي تكون حساسة للغاية في هذه المرحلة. إذ إن إضافة الوسط بسرعة كبيرة ستؤدي إلى خفض نسبة الحيوية بشكل ملحوظ.

ضع طبق الـ 96 بئراً الذي يحتوي على العينات المنقولة إليها الجينات ووسط RPMI 1640 في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة Celsius ونسبة 5%CO2 لمدة دقيقتين أو أكثر. من الضروري السماح للخلايا بالتعافي قبل إجراء أي عمليات معالجة إضافية. بعد إخراج الطبق من الحاضنة، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل الخليط بعناية من كل بئر إلى طبق زراعة أنسجة بـ 96 بئراً.

بعد ذلك، وباستخدام الماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من وسط DMEM مع FBS إلى كل بئر. يتم التحضين لمدة تتراوح من 24 إلى 36 ساعة، ثم يُجرى قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد عملية عفن الخلية والتعافي. ولتقييم كفاءة عفن الخلية لـ SI irna المسمى فلوريسنتيًا، يجب أن يكون أكثر من 99% من الخلايا قد تعرضت لعفن الخلية في اليوم التالي لاختبار كفاءة العفن. أما بالنسبة لكفاءة عفن الخلية لبلازميد GFP، فيجب أن تعبر 30 إلى 50% من الخلايا عن GFP. بعد التحضين لمدة 24 إلى 36 ساعة، قم بتحضير LPS أو منشطات المناعة الفطرية الأخرى في وسط طازج، حيث يتم تخفيف LPS ليصل إلى تركيز نهائي قدره 20 ng/mL في وسط DMEM مع FBS.

بعد ذلك، اسحب الوسط بعناية من طبق الـ 96 بئراً وأضف الوسط الطازج الذي يحتوي على LPS إلى الخلايا. ضع الطبق في الحاضنة لمراقبة الاستجابة لـ LPS أو غيره من محفزات المناعة الفطرية في أوقات مختلفة بعد التحفيز. انقل المادة الطافية من الخلايا باستخدام الماصة إلى طبق تخزين ذي 96 بئراً لتحليلها بواسطة Eliza.

بعد إزالة السائل الطافي لمراقبة حيوية الخلايا، أضف 100 µL من ثنائي أسيتات الفلوريسين (fluorescein diacetate) بتركيز 1:100 في PBS إلى كل بئر، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من دقيقة واحدة إلى خمس دقائق. راقب الفلورة في الخلايا باستخدام قارئ الأطباق (plate reader) عند تحلل المركب بواسطة الإستيرازات الخلوية في الخلايا الحية. يصبح هذا المركب فلورياً لتوضيح فائدة هذا النهج في مراقبة الاستجابة المناعية الفطرية.

تم ترانسفكشن جزيئات siRNAs التي تستهدف جينات تنظيم المناعة الفطرية المعروفة في الخط الخلوي للخلايا البلعمية raw 2 64 0.7. بعد ذلك، تم تحفيز الخلايا باستخدام LPS ومراقبة إنتاج السيتوكينات المحرضة للالتهاب IL six و TNF alpha عن طريق مقايسة Eliza كما هو موضح هنا.

تثبيط المستقبل الشبيه بالتول 4، وهو المستقبل الخاص بـ LPS، دون التأثير على المستقبلات الشبيهة بالتول الأخرى. وباستخدام SIR، حدث انخفاض ملحوظ في إنتاج IL 6 و TNF alpha المستحثين بواسطة LPS. يلاحظ أن تثبيط IL 6 باستخدام irna قد قلل من إنتاج IL 6، ولكنه لم يؤثر على إنتاج TNF alpha.

تشير هذه البيانات إلى فعالية جيدة ونوعية جيدة لعملية تثبيط التعبير الجيني بوساطة siRNA للمنظمات المرشحة للمناعة الفطرية. ومن المهم تذكر أن مفتاح عملية ترانزفكشن ناجحة واستعادة جيدة للخلايا يكمن في العمل مع خلايا صحية للغاية، والتعامل معها برفق أثناء عملية الترانزفكشن والاستعادة، والعمل بسرعة بمجرد وضع الخلايا في محلول المؤثر النووي. وباتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء العديد من المقايسات الأخرى، بما في ذلك QPCR لمراقبة تثبيط التعبير الجيني والعديد من المقايسات الأخرى لاستقصاء الاستجابة المناعية الفطرية.