باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تداخل الحمض النووي الريبي للتحقيق في تأثير الجينات المرشحة على الاستجابة المناعية الفطرية. في البلاعم الفأرية للقيام بذلك ، يتم إضفاء خطوط خلايا البلاعم على الفأر ودمجها مع محلول التعداء والحمض النووي الريبي SI ذي الأهمية ، ثم يتم نقل الخليط إلى لوحة VETE نواة 96 جيدا ويستخدم نظام تعداء Maxa 96 Well لنقل siRNA إلى البلاعم وبعد الحضانة مع ثقافة الخلايا ، يتم تطبيق الوسيط أو LPS أو غيرها من المنشطات للمناعة الفطرية على البلاعم المنقولة لتحفيزها. أخيرا ، يتم إجراء Eliza بعد ذلك لمراقبة إنتاج السيتوكين وتقييم تأثير علاج siRNA على الاستجابة المناعية الفطرية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التعداء بوساطة الدهون هي أن مقياسنا قوي ويمكن تطبيقه على العديد من الجينات في مهنة الإنتاجية العالية. مفتاح هذه الطريقة هو العمل مع الخلايا السليمة ومعالجتها بلطف والعمل بكفاءة أثناء عملية التعداد. كما سنوضح ، يستخدم هذا البروتوكول خط خلية البلاعم الماوس الخام 2 64 0.7 ، والذي يتم زراعته كما هو موضح في المستند المصاحب.

استعدادا للوحة تعداء INA ، تنمو الخلايا بنسبة 20٪ بطلاقة مشتركة لمدة يوم أو يومين حتى لا تزيد الخلايا عن 80٪. من المهم أن تتذكر استخدام الخلايا التي تقع بين الممرات الثالثة والعاشرة. بعد الذوبان ، ابدأ هذا الإجراء ببرمجة نظام مكوك 96 جيدا الذي سيتم استخدامه في التعداد.

للقيام بذلك ، قم ببدء برنامج مكوك البئر 96 على الكمبيوتر المتصل بالمكوك من قائمة الملفات العلوية اليسرى. حدد ملف معلمة جديد. قم بتمييز الآبار التي سيتم نقلها على الرسم التخطيطي المعروضة 96 لوحة البئر.

سيشير المربع الأخضر إلى الآبار المحددة. اختر البرنامج الذي يتوافق مع خط خلية البلاعم المستخدم للخلايا الأولية 2 64 0.7. اختر DS 1 36 حدد تطبيق.

لاحظ أنه بعد تحديد البرنامج ، سيتم تلوين الآبار الموجودة على اللوحة التخطيطية. تشير الدوائر الفارغة ذات اللون الأزرق الداكن إلى الآبار التي لم يتم تعيين برنامج لها ولن تصاب بالصدمة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مستجيب النواة العامل عن طريق خلط خط خلية SF 96 جيدا محلول مستجيب النواة مع المحتويات الكاملة لأنبوب الملحق المضمن.

اسمح للكواشف المختلطة بالتوازن في درجة حرارة الغرفة. قم بتسخين D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25٪ tripsin EDTA و PBS عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد البلازميد التجريبي للتحكم في S-I-R-N-A-P max GFP أو siRNAs المصنفة بالفلورسنت عن طريق إذابتها على الجليد لفصل البلاعم الملتصقة عن أطباق زراعة الخلايا.

استنشق الوسط واغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من PBS. ثم بعد إزالة PBS ، احتضان الخلايا بملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين في EDTA لكل لوحة حتى تبدأ الخلايا في الانفصال. يستغرق هذا من دقيقة إلى دقيقتين.

اضغط برفق على اللوحة وحرك المحلول أثناء الحضانة لزيادة التربسين إلى أقصى حد. بعد انفصال الخلايا ، أضف تسعة ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى خلط FBS برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، ثم اجمع الخلايا عن طريق سحب العينة في أنبوب معقم. احسب عدد البلاعم المعزولة باستخدام مقياس الخلوي Hema.

توقع ما يقرب من 10 ملايين بلاعم لكل صفيحة 10 سنتيمترات. احسب العدد الإجمالي للبلاعم المطلوبة لكل بئر على مكوك البئر 96 يتطلب 200،000 خلية. الماصة العدد المحسوب من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي.

قم بتدوير الخلايا لمدة 10 دقائق عند 150 جم في درجة حرارة الغرفة إلى صفيحة سفلية مستديرة معقمة 96 جيدا ، مما يسهل الخلط مع تقليل فقدان الكاشف. أضف ميكرولترين من كل IRNA إلى كل بئر ليتم نقله. لاحظ أنه اعتمادا على عدد siRNAs ، يمكن تحقيق ذلك أثناء خطوة الطرد المركزي للبلاعم.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو التثقيب الكهربائي ، وهي المفاتيح التي تعالج الخلايا بلطف شديد وتعمل بسرعة كبيرة. بمجرد أن تصبح الخلايا في محلول تعداء سام ، قم بشفط الوسط من خلايا الطرد المركزي ، ثم أعد تعليقها برفق في محلول مستجيب النواة. SF يحتوي على محلول الملحق.

انقل الخلايا على الفور إلى حوض معقم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وانقل 20 ميكرولترا من خليط الخلايا المعلق إلى كل بئر من لوحة البئر 96 التي تحتوي على siRNAs الممزوجة بلطف عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، انقل 20 ميكرولترا من خليط INA الخلية إلى لوحة 96 نواة جيدا. من الأهمية بمكان تجنب توليد الفقاعات خلال هذه الخطوة لأن هذا يمكن أن يسبب أخطاء أثناء المودة النووية.

بعد وضع جميع العينات التجريبية في لوحة التعداء ، قم بتغطيتها بالغطاء المرفق واضغط عليها برفق شديد على سطح صلب. لإزالة أي فقاعات، ضع لوحة البئر 96 في مكوك مستجيب نواة 96، وفي أسفل يمين شاشة البرنامج، حدد تحميل وبدء. ثم اتبع موجه البرنامج لحفظ النتائج أثناء عملية النوة عاطفة الآبار بنجاح.

سيتم تصوير Transfected على التخطيطي للبئر 96 على الشاشة بواسطة دائرة خضراء مع علامة زائد. تشير الدائرة الحمراء ذات علامة الطرح إلى وجود خطأ على الأرجح بسبب الفقاعات أو سحب الحجم غير الصحيح للكواشف مباشرة بعد عاطفة النواة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 80 ميكرولترا من RPMI 1640 الدافئ مسبقا.

متوسطة إلى جانب كل منها. حسنا ، اسمح للوسط بالاختلاط ببطء مع الخلايا المنقولة ، والتي تكون حساسة للغاية في هذه المرحلة. ستؤدي إضافة الوسيط بسرعة كبيرة إلى تقليل الجدوى بشكل كبير.

ضع لوحة البئر 96 مع عينات منقولة و RPMI 1640 في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة دقيقتين أو أكثر. من الأهمية بمكان السماح للخلايا بالتعافي قبل مزيد من التلاعب. بعد إزالة اللوحة من الحاضنة، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل الخليط بعناية من كل بئر إلى لوح زراعة أنسجة 96 بئر.

ثم مرة أخرى، باستخدام الماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من DMEM مع FBS إلى كل منها. احتضان جيدا لمدة 24 إلى 36 ساعة مباشرة بعد التعدي والتعافي ، وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي. لتقييم كفاءة تعداء SI irna المسمى بالفلورسنت ، يجب نقل أكثر من 99٪ من الخلايا في اليوم التالي لمقايسة التعدي لكفاءة تعداء البلازميد GFP ، يجب أن تعبر 30 إلى 50٪ من الخلايا عن GFP بعد الحضانة من 24 إلى 36 ساعة ، قم بإعداد LPS أو المنشطات الأخرى للمناعة الفطرية في وسط جديد لتخفيف LPS إلى تركيز نهائي يبلغ 20 نانوغرام لكل مليلتر في DMEM مع FBS.

ثم قم بشفط الوسط بعناية من لوحة البئر 96 وأضف الوسط الجديد الذي يحتوي على LPS إلى الخلايا. ضع اللوحة في حاضنة لمراقبة الاستجابة ل LPS أو المحفزات الأخرى للمناعة الفطرية في أوقات مختلفة بعد التحفيز. ماصة المادة الطافية من الخلايا إلى لوحة تخزين 96 بئر لتحليلها بواسطة إليزا.

بعد إزالة المادة الطافية لمراقبة صلاحية الخلية ، أضف 100 ميكرولتر من واحد إلى 100 أسيتات فلورسين في PBS إلى كل بئر يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. راقب التألق في الخلايا باستخدام قارئ اللوحة عند شقها بواسطة الإسترازات الخلوية في الخلايا الحية. يصبح هذا المركب فلوريا لتوضيح فائدة هذا النهج لمراقبة الاستجابة المناعية الفطرية.

تم نقل siRNAs التي تستهدف الجينات التنظيمية المناعية الفطرية المعروفة إلى خط خلايا البلاعم الخام 2 64 0.7. ثم تم تحفيز الخلايا باستخدام LPS وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات. تمت مراقبة IL six و TNF alpha بواسطة Eliza كما هو موضح هنا.

تثبيط المستقبلات الشبيهة بالحصيلة أربعة ، مستقبل LPS ، ولكن ليس TLRs الأخرى. باستخدام SIR ، أدى الإنتاج المتناقص بشدة ل LPS إلى IL six و TNF alpha. لاحظ أن تثبيط IL six مع irna قلل من إنتاج IL six ، لكنه لم يؤثر على إنتاج عامل نخر الورم ألفا.

تشير هذه البيانات إلى فعالية جيدة وخصوصية جيدة للضربة القاضية بوساطة siRNA للمنظمين المرشحين للمناعة الفطرية. من المهم أن تتذكر أن مفتاح التعداء الجيد والتعافي الجيد للخلايا هو العمل مع خلايا سليمة جدا ، ومعالجتها بلطف أثناء عملية التعدي والتعافي ، والعمل بسرعة بمجرد أن تكون الخلايا في محلول مستجيب النواة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء العديد من المقايسات الأخرى بما في ذلك QPCR لمراقبة ضربة قاضية للجينات والعديد من المقايسات الأخرى للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية.