تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 'نهاية الشق من قبل مرنا ركائز في المختبر
May 3rd, 2014
الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني يجمع على الحمض النووي الريبي السلائف الذي يمتد إلى ما بعد نهاية 3 'من مرنا ناضجة. يتم إنشاء نهاية الحمض النووي الريبي ناضجة cotranscriptionally، في موقع تمليها تسلسل الحمض النووي الريبي، عن طريق النشاط نوكلياز داخلية للمجمع الانقسام. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة لدراسة تفاعلات الانقسام في المختبر.
الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص ثلاثة انقسام رئيسي للرنا المرسال بنجاح في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع مستخلص نووي نشط نسخيا أولا من الخلايا المزروعة في التعليق. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في عمل ركائز RNA ذات علامة راديو عبر النسخ في المختبر.
الخطوة الثالثة هي تنقية ركائز الحمض النووي الريبي المسماة. الخطوة الأخيرة هي تجميع تفاعل الانقسام ، بما في ذلك المستخلص النووي وركيزة الحمض النووي الريبي المسماة. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج ثلاثة ركائز mRNA أولية ، وركائز مشقوقة UNC ، ومنتج مشقوق من خلال الرحلان الكهربائي للهلام المشع العمودي.
يعدالعرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما ، على الرغم من أنه تم إجراؤه منذ الثمانينيات ، إلا أنه لا يمكن تنفيذه بسهولة نظرا لوجود العديد من الخطوات المحددة طوال الإجراء التي تمثل تحديا. غسلت الخلايا ، حبيبات ، وجاهزة للتحلل. لبدء هذا البروتوكول إلى حبيبات الخلية ، أضف المخزن المؤقت باستخدام DTT الجديد.
أضف خمسة مجلدات من CPV المقدرة واستخدم ماصة لتفتيت الحبيبات والسماح للتعليق بالتبريد على الجليد. بعد 10 دقائق ، قم بتدوير الخلايا لأسفل عند أربع درجات مئوية في دلو متأرجح. جهاز الطرد المركزي يستنشق بعناية من المادة الطافية.
سوف تمتص الحبيبات بعض المحلول وتضخم في الحجم. ثم أضف واحدا CPV من المخزن المؤقت A ، وقم بتفكيك الحبيبات برفق باستخدام طرف ماصة. صب المعلق في الخالط المبرد ، وبخمس إلى 12 ضربة من مدقة ضيقة في الخلايا.
قم بإزالة كمية صغيرة ، وقم بتطبيق trian blue وتحقق من الخلايا لتحديد اكتمال تحللها. إذا لزم الأمر ، استمر في تجانس الخلايا حتى يتم تحللها بنسبة 90٪ ، لكن لا تبالغ في ذلك. الآن انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي فائق الوضوح.
سجل الحجم الإجمالي وقم بتدويره كما فعلت سابقا. استنشق المادة الطافية الغائمة واحفظها على الجليد. ولتحليل العصارة الخلوية ، احرص على عدم إزعاج الحبيبات.
يحتوي على النوى. بعد ذلك ، قم بتدوير الحبيبات بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الحجم الصغير من المادة الطافية المتبقية وقم بتجميعها مع مجموعة العصارة الخلوية.
ثم حدد الحجم النووي PACT. أضف حجما يعادل المخزن المؤقت C إلى الحبيبات. ثم قم بإزاحة الحبيبات باستخدام الماصة في الخالط النظيف.
استخدم خمس إلى 10 ضربات مدقة ضيقة للريس. تعليق الحبيبات. انقل المتجانس إلى أنبوب مبرد واخلطه عن طريق الانعكاس لمدة 30 دقيقة.
عند أربع درجات مئوية ، يمكن استخدام صفيحة التقليب. إذا كان الحجم كبيرا بما فيه الكفاية ، فقم بنقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي فائق الوضوح وعند أربع درجات مئوية ، قم بتدويرها لأسفل لمدة 30 دقيقة. عند حوالي 25،000 جرام ، يكون المادة الطافية هي المستخرج النووي.
باتباع بروتوكول النص ، أكمل غسيل الكلى من ميكروغرام واحد فقط من القالب. قم بإعداد المسبار عن طريق النسخ في المختبر باستخدام مجموعة مع مروج متوافق مع SP six أو T seven. عند تحميل الصفحة ، استخدم ثلاثة ميكرولترات من العلامة وكل 25 ميكرولترا من التفاعل لكل ركيزة RNA.
امنع أيضا التلوث المتبادل عن طريق تباعد ممرات النصوص ذات الحجم المماثل. قم بتشغيل الجل بحيث يعمل مسبار 600 نيوكليوتيد بقوة 25 واط لمدة ساعتين تقريبا بعد ذلك. لتحديد موقع أشرطة الجل ، قم بإضاءة الفيلم المكشوف بصندوق ضوئي وضع الجل الملفوف في الأعلى.
قم بمحاذاة علامة الراد التلقائي والعلامة المكشوفة على الفيلم. ثم ضع علامة على مواقع الشريط بعلامة سوداء لإزالة الأربطة: قم بفك غلاف الجل. وباستخدام شفرة نظيفة ، قم باستئصال أقسام الشريط من الجل ، ونقل كل قسم إلى الأنبوب الخاص به ، وإخراج الحمض النووي الريبي باتباع الإجراءات القياسية.
بعد تحضير جميع الكواشف ، قم بتسخين الحمض النووي الريبي المسمى إلى 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. ثم انقل الحمض النووي الريبي إلى دوامة الجليد ، 10٪ PVA ، ثم قم بتدويرها بسرعة عالية لبضع دقائق لإزالة الفقاعات ، ثم تابع عمل الخلطات الرئيسية لكل تفاعل. لكل تفاعل ، قم بتوزيع 5.25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي واحد.
بعد ذلك ، أضف 6.25 ميكرولتر من مزيج المستخلصات النووية. ثم أضف ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي الريبي المسمى المخففة إلى 50 مولار في المجموع. يستخدم كل تفاعل أقل من خمسة ضلب أنو يسمى الحمض النووي الريبي.
الآن ، قم بتدوير الدوامة برفق وقم بتدوير مزيج التفاعل بسرعة. اترك التفاعل يحدث لمدة تصل إلى ساعتين عند 30 درجة مئوية. سيوفر أخذ دورة زمنية للتفاعل أفضل النتائج بعد استخدام البروتيناز K لهضم البروتين في التفاعل ثم تنقية التفاعل باستخدام طريقة كلوروفورم الفينول ، قم بتشغيل المنتجات على تحميل صفحة بنسبة 6٪ ، أو ثلاثة ميكرولتر من العلامة أو خمسة ميكرولترات لكل منتج تفاعل لكل حارة.
ثم قم بتشغيل الجل ثم قم بتفكيك جهاز الجل بعناية. لجمع الجل ، اضغط على ورق الترشيح بقوة عليه واقلبه. اضغط بقوة على الزجاج للتأكد من أن الجل ممسك بالورق بالكامل.
ثم قشر ورق الترشيح ببطء مع توصيل الجل. لف الجانب المكشوف من الجل بالبلاستيك وقم بلصق الغلاف على ورق الترشيح على الجانب الآخر. انتهي بوضع الجل في مجفف لمدة 15 دقيقة مع توجيه ورق الترشيح للمكنسة الكهربائية.
في وقت لاحق ، قم بتحليل الجل عن طريق تعريضه لفيلم أو تصوير فوسفو. المشقوقة. ركيزة الحمض النووي الريبي هي أبطأ نطاق مهاجر في الجزء العلوي من الجل.
المنتج المشقوق المحدد الذي يتميز بسهم غامق ، يعمل بشكل أسرع في الجل بالحجم المتوقع. هذا المنتج غائب عن عنصر التحكم مع طفرة نقطية في تسلسل حبض. تم تحديد القياس الكمي لنشاط الانقسام باستخدام مخطط متري DS.
مقارنة نسبة المشقوق إلى المشقوق ، الحمض النووي الريبي ، الذي تم تطبيعه مع التحكم في الحمض النووي الريبي المشقوق. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة polyadeenylation للإجابة على أسئلة إضافية مثل نشاط بوليميراز polyA. يتم إجراء هذا الاختبار عن طريق تغيير ظروف التفاعل مثل إضافة المغنيسيوم وإزالة EDTA.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تركز هذه الدراسة على فحص الانقسام الثلاثي للحمض النووي الريبي المرسال في المختبر، وهو عملية حاسمة في نضج الحمض النووي الريبي. تتضمن الطريقة استخدام مستخلص نووي نشط ناسخيًا وركائز الحمض النووي الريبي المشعة لتحليل تفاعلات الانقسام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الحمض النووي الريبي
- البيولوجيا الجزيئية
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- تقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي II بتصنيع الحمض النووي الريبي السلف الذي يمتد ما وراء النهاية 3' للحمض النووي الريبي الناضج.
- يحدد معقد الانقسام الموقع لتوليد الحمض النووي الريبي الناضج.
- العمليات المصاحبة للنسخ ضرورية لنضج الحمض النووي الريبي.
- يمكن أن يوفر فهم تفاعلات الانقسام رؤى حول آليات معالجة الحمض النووي الريبي.
هدف الدراسة
- لفحص الانقسام الثلاثي للحمض النووي الريبي المرسال في المختبر.
- لفهم دور المستخلص النووي في معالجة الحمض النووي الريبي.
- لتحليل منتجات تفاعلات الانقسام باستخدام هجرة الجل الكهربائي.
الطرق المستخدمة
- تحضير مستخلص نووي نشط ناسخيًا من الخلايا المزروعة في تعليق.
- تصنيع ركائز الحمض النووي الريبي المشعة عبر النسخ في المختبر.
- تنقية الجل للركائز المشعة من الحمض النووي الريبي.
- تجميع تفاعلات الانقسام مع المستخلص النووي وركائز الحمض النووي الريبي المشعة.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة انقسام ناجح لركائز الحمض النووي الريبي المرسال الثلاثية.
- تم تحليل النتائج من خلال هجرة الجل الكهربائي المشعة العمودية.
- تم تحديد ركائز الحمض النووي الريبي المقسمة من قبل UNC والمنتجات المقسمة.
- توفر المنهجية إطارًا لدراسة تفاعلات انقسام الحمض النووي الريبي.
الاستنتاجات
- تحدد هذه الدراسة طريقة موثوقة لفحص انقسام الحمض النووي الريبي المرسال في المختبر.
- يمكن أن يعزز فهم آليات الانقسام المعرفة بمعالجة الحمض النووي الريبي.
- تسهم النتائج في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي الأوسع.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
