عزل CA1 النووي المخصب الكسور من شرائح الحصين لدراسة تعتمد على نشاط استيراد النووية من رسول البروتينات Synapto النووية

نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحريض التقوية على المدى الطويل في المنطقة CA1 من الحصين والعزلة اللاحقة الكسور التخصيب النووية من منطقة tetanized للشريحة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد النشاط يعتمد استيراد البروتين النووي في النماذج الخلوية التعلم والذاكرة.

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة النقل المكوكي السيتوبلازمي المعتمد على النشاط للبروتينات باستخدام شرائح الحصين الحادة حيث يتم الحفاظ على الاتصال العصبي والوظيفة بشكل جيد لتحقيق هذا الهدف ، يتم أولا عزل الحصين لذكور الفئران البالغين ويتم تحضير شرائح عرضية حادة كخطوة ثانية. يتم نقل شرائح الحصين إلى غرفة التسجيل ويتم تحفيز الشكل المتأخر ل LTP في ذرة نصف الطبقة CA الواحدة. بعد ذلك ، يتم قطع الشرائح المعززة والتحكم المجمدة ، ويتم تشريح مناطق كاليفورنيا واحدة المحفزة من أجل عزل الجزء المخصب النووي لمزيد من تحليل البقع المناعية.

تظهر النتائج المستندة إلى تحليل النشاف الغربي اختلافات في مستويات البروتين الفوسفوسي النووي بين الشرائح المنشطة والشرائح الضابطة بعد 30 دقيقة من تحريض LTP. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لسببين. أولا ، الكمية المنخفضة من عينة الأنسجة ، وثانيا ، الإطار الزمني الحرج الذي يتكرر لتحلل العينات في المخزن المؤقت للتحلل منخفض التوتر ، مما يسمح بإطلاق النوى يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن إعداد حياة الحصين وعزل منطقة C one يتطلب تشريحا سريعا ودقيقا للغاية ، ولكن هناك بعض الحيل.

لتسهيل الأمر ، سيحتاج المرء إلى اتباع كل من التعليمات المكتوبة والمرئية لإعداد الجزء المخصب النووي من منطقة C من الحصين. سيتم إجراء عرض التحلل للإجراء بواسطة مختبر بريد الصنوبر. سوف توضح كيفية تحضير تحلل الحصين الحاد وتحفيز LTP.

بعد تشريح منطقة C من خلال Berra g ، سيوضح لك الطالب من مختبرنا كيفية عزل الأسلحة النووية والتدمير. ابدأ هذا الإجراء بعزل دماغ الفئران وغمره في محلول النظرة الباردة المثلجة الغازية مسبقا. بعد ذلك ، قم بإزالة المخيخ وجزء من القشرة المعوية.

افصل نصفي الكرة القشرية بقطع سهمي متوسط. بعد ذلك ، قم بعمل قطع من 50 إلى 70 درجة على طول الحافة الظهرية لكل نصف كرة الأرضية. ثم ضع كل نصف كرة أرضية لأسفل على سطحه الإنسي ، وغراء كل نصف كرة مع السطح المقطوع حديثا على منصة التقطيع للاهتزاز.

بعد ذلك قم بتغطية المنصة بمحلول النظرة الباردة المثلجة قبل الكربوجين. قطع شرائح 350 ميكرومتر تحتوي على تشكيل الحصين القشرة تحت والأمعاء من الجانب الأمامي إلى الجانب الخلفي مع الاهتزاز. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى حاضنة من النوع U والمغمورة واحتضانها لمدة ساعتين على الأقل عند 32 درجة مئوية باستخدام الكربوجين A CSF.

الآن انقل شريحة الحصين إلى غرفة التسجيل من النوع المغمور المثبتة تحت المجهر. يتم حشو الشريحة بالكربونات السائل النخاعي بمعدل ستة ملليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 32 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة ، املأ الأقطاب الكهربائية الزجاجية الشعرية الدقيقة بالسائل الدماغي النخاعي.

ضع قطبا كهربائيا صغيرا في CA واحد من الألياف الجانبية Schaefer للتحفيز ، وآخر في ذرة جاهزة لطبقة واحدة لتسجيل EPSPs الميدانية بمسافة 300 ميكرومتر. ثم استحضر المجال EP SSPs عن طريق توصيل ثلاثة إلى أربعة فولت بواسطة نبضات تيار مستطيلة طورية إلى ألياف Schafer الجانبية. قم بإجراء اختبار التحفيز الأقصى عن طريق قياس علاقة خرج الإدخال وتحديد قوة التحفيز على أنها 40٪ من الحد الأقصى لقيمة ميل EPSPs للمجال.

بعد ذلك ، سجل خط الأساس لمدة 15 دقيقة على الأقل عن طريق قياس الاستجابات لاختبار المحفزات كل دقيقة طوال التجربة. للحث على LTP المتأخر ، قم بتطبيق tein عالي التردد لزيادة EPSPs المجال المستحث في منطقة واحدة تقريبا. ضع خمسة ميكرومولار بواسطة COE على السائل الدماغي النخاعي A قبل دقيقتين من التتين واغسلها مباشرة بعد آخر كزاز.

أوقف التسجيل. بعد دقيقتين أو 30 دقيقة من تحريض LTP المتأخر بعد ذلك ، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية ونقل الشريحة بسرعة إلى منصة معدنية مبردة مسبقا موضوعة على الثلج الجاف. ثم اجمع كل شريحة في أنبوب أورف 1.5 مليلتر وقم بتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية.

في هذه الخطوة ، أخرج الشرائح المجمدة من سالب 80 درجة مئوية واحتفظ بها على الجليد. أضف 0.5 مل من محلول TBS البارد الطازج الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز في الأنبوب. احتضنها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل نقلها إلى مجهر استريو.

بعد ذلك ، قم بتشريح منطقة CA من طبقة واحدة من الحصين عن طريق إمساك الشريحة بإبرة واحدة وقطع منطقة CA مع الأخرى. بعد ذلك ، اجمع مناطق كاليفورنيا الواحدة التي تم تشريحها من خمس شرائح لكل مجموعة في أنبوب مليلتر جديد من نقطة واحدة يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول التحلل. ثم قم بتجانس الأنسجة المجمعة عن طريق سحب العينات بعناية لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.

احتضان المحللة على الجليد لمدة خمس إلى سبع دقائق للسماح للخلايا بالانتفاخ. بعد ذلك ، خذ ميكرولترين من المحللة وقم بإسقاطه على شريحة مجهرية. تصور تورم الخلايا تحت مجهر المجال الساطع.

تظهر النوى كهياكل مستديرة سليمة مع تورم مناسب. الآن ، اجمع 20 ميكرولترا من العينة في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر كجزء متجانس. أضف ثمانية ميكرولترات من تغيير طبيعة أربعة عينة XSDS.

ثم الطرد المركزي للمحللات المتبقية عند 1100 RCF لمدة دقيقة واحدة. بعد دقيقة واحدة ، اجمع المادة الطافية بعناية من الأعلى وانقله إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من أربعة × عينة عازلة.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت منخفض التوتر وأضف 20 ميكرولتر من أربعة × عينة عازلة. يشار إلى هذا الكسر باسم جزء مخصب نووي. قم بتخزين الكسور المتجانسة والعزلية الخلوية والنووية المخصبة عند سالب 20 درجة مئوية أو سالب 80 درجة مئوية.

من أجل النشاف المناعي اللاحق في هذا الإجراء ، قم بإذابة العينات وغليها لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية قبل قياس تركيز البروتين عن طريق اختبار AM mito black ، أو حمل اختبار BCA ، وهي كمية متساوية من عينات البروتين من الكسور المتجانسة والسيتوبلازمية والنووية المخصبة. في صفحة SDS ، يجب وضع عينات هلامية من شرائح التحكم و LTP على نفس الجل للمقارنة المباشرة في اللطخة الغربية. يوضح هذا الشكل بقعة مناعية للأجزاء المتجانسة والعصارة الخلوية والنووية المخصبة من محللة كاليفورنيا واحدة التي تم فحصها باستخدام علامات العصارة الخلوية والنووية.

هذا هو تحليل اللطخة المناعية لمستويات PJS 180 في المتجانس بعد دقيقتين و 30 دقيقة من تحريض التين ، وهذا هو تحليل الدم المناعي لمستويات PJS 180 في الجزء المخصب النووي. بعد دقيقتين و 30 دقيقة من إزالة فوسفو ، ظلت مستويات جاكوب دون تغيير في إجمالي تجانس البروتين CA الواحد وفي الجزء المخصب النووي بعد دقيقتين من التجانس. ولكن تم العثور على زيادة كبيرة في p Jacob ، S 180 Immunoreactivity بعد 30 دقيقة من تحريض LTP.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام حجم مناسب من صمام التحلل ناقص التوتر. أيضا ، يجب توحيد الإطار الزمني الحرج لتحلل العينات. على وجه الخصوص ، عند تطبيق هذه الطريقة لعزل عينات أنسجة دماغ الفئران أو الفئران من العينات بخلاف الحصين ، بعد هذا الإجراء ، يمكن أن تكون الطرق الأخرى مثل التلوين المناعي التكميلي بالأجسام المضادة ضد البروتينات المرشحة المستوردة إلى النواة بعد تحريض OTP أو جزيئات الإشارات مثل الأشكال النشطة من الكيناز أو الفوسفاتيز ، مفيدة للتحقق من هذه النتائج.

يمكن إجراء العلاج الدوائي للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال ، ما هي شلالات الإشارات التي تشارك في نقل بروتين نووي متشابك ، أو كيف تؤثر على وظيفة نووية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء أن يدرس دور بروتينات المرسال النووية المشبك في الأمراض التي تنطوي على الحصين.

على سبيل المثال ، مرض الزهايمر.