البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تحديد الجينات أو المسارات المشاركة في عملية تكوين الأوعية الدموية من خلال استخدام طريقة مخبرية كمية وسريعة. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق تجويع الخلايا البطانية الأولية أو المخلدة من المصل في اليوم السابق للمقايسة. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضين الخلايا البطانية مع الكالسيني لمدة 30 دقيقة، يليه غسل الخلايا باستخدام PBS.

بعد ذلك، يتم تعريض الخلايا البطانية للتريبسين وتصفيتها لإزالة التكتلات ثم عدّها. وتتمثل الخطوة النهائية في دمج الخلايا البطانية مع وسط مُكيّف يحتوي على عوامل محتملة لتكوين الأوعية الدموية وتوزيعها فوق مستخلص غشاء قاعدي متصلب. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الضوئي أو المجهر الفلوري لتصور شبكات الأنابيب، والتي يمكن بعد ذلك قياسها كمياً باستخدام برامج حاسوبية متخصصة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى لقياس تكوين الأوعية الدموية في سهولة إعدادها، وتكلفتها المنخفضة نسبياً، وقدرتها على إنتاج أنبيبات في غضون ساعات، كما أنها قابلة للقياس الكمي لتوضيح هذه التقنية. هل إريكا بولوينكل طالبة دراسات عليا في قسم البيولوجيا بالجامعة الأمريكية؟ باستخدام الوسط المناسب، انقل ثلاث خلايا B 11 إلى قارورة جديدة قبل يومين من بدء المقايسة؛ وللحصول على أفضل النتائج، يجب أن تكون الخلايا بين الممر الثاني والسادس عند الاستخدام.

بعد ذلك، يتم إنماء الخلايا لمدة 24 ساعة في وسط dmm المكمل. وعندما تصبح الخلايا جاهزة، يتم تجويعها من المصل. من خلال استبدال الوسط بوسط يحتوي على مصل مخفض، يتم إنماء الخلايا المجوعة من المصل لمدة 24 ساعة إضافية.

للحصول على أفضل النتائج، من المهم التأكد من الشركة المصنعة أن تركيز المحلول المخزون من BME هو 10 mg/mL. قم بإذابة BME عامل النمو المختزل في الثلاجة. وبما أن BME يتصلب عندما يكون دافئًا، فيجب الحفاظ عليه باردًا قبل الاستخدام.

بعد ذلك، قم بإذابة الأوساط اللازمة للمقايسة لغرض التصوير بالمجهر الفلوري أو المجهر البؤري، وأضف calcein AM إلى الأوساط بتركيز نهائي قدره 2 µg/mL، ثم ضع الخلايا المصبوغة بـ calcein AM في الظلام لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة. بعد هذه المدة، قم بإزالة الأوساط واغسل خلايا 3B11 باستخدام DPBS. بعد ذلك، قم بهضم الخلايا بإضافة 1 mL من trypsin-EDTA، وبعد اكتمال عملية الهضم.

أعد تعليق الخلايا حتى يصل الحجم النهائي إلى 10 milliliters. وفي وسط dmm المكمل، قم بإزالة أي تكتلات من الخلايا عن طريق ترشيحها باستخدام مصفاة خلايا بقطر 100 micrometer. بعد عد الخلايا، أعد تعليقها للوصول إلى التركيز النهائي الصحيح لبدء مقايسة تكوين الأنابيب المبردة.

يتم تحضير طبق يحتوي على 24 بئراً ورؤوس ماصات سعة 1 مللمتر لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة قبل التعبئة. يمنع هذا الإجراء تجمد الـ BME قبل الأوان عند البدء في العملية. يتم سحب 250 µL من الـ BME الخاص بعامل النمو المختزل وتوزيعه في كل بئر من آبار الطبق ذي الـ 24 بئراً. يجب تجنب تكوين الفقاعات عن طريق عدم الضغط على الماصة حتى التوقف النهائي.

عند استخدام الماصة، وبمجرد ملء الآبار، تحقق من بقاء كمية كافية من BME في مركز البئر. فعندما يتكون السطح المقعر، إذا كانت المصفوفة رقيقة جدًا، ستشكل الخلايا طبقة أحادية فقط. بعد ذلك، قم بحضن الطبق لمدة 30 دقيقة حتى يتصلب BME.

بمجرد تجمّد الـ BME، امزج حوالي 300 µL من الوسط المكيّف مع 10 µL من خلايا three B 11 المعاد تعليقها، ثم وزع معلق الخلايا على آبار الطبق. بعد وضع الطبق في الحاضنة، ستبدأ الأنابيب في التشكل خلال ساعتين إلى أربع ساعات؛ وبناءً على تركيز العامل المولد للأوعية في الوسط المكيّف، قد يحدث ذروة تشكّل الأنابيب بين 3 و12 ساعة. سيتعين تحسين توقيت المقايسة وفقًا لشروط كل دراسة على حدة.

غالبًا ما تبدأ الأنابيب في التدهور خلال 18 ساعة، وتخضع الخلايا البطانية للموت الخلوي المبرمج في وقت ذروة تكوين الأنابيب. قم بشفط الوسط من البئر بعناية لتجنب تعطيل شبكة الأنابيب. بعد ذلك، اغسل كل بئر باستخدام 1 mL من DPBS من أجل التصوير المباشر.

أضف 1 mL من محلول DPBS الطازج إلى كل بئر، وقم بتصوير شبكة الأنابيب باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope) لتثبيت شبكة الأنابيب من أجل التصوير اللاحق. أضف 4% بارالدهيد إلى كل بئر تم شفط السوائل منه، واحضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة البارافورمالدهيد، اغسل البئر مرتين باستخدام DPBS، ثم أضف 1 mL من محلول DPBS الطازج إلى كل بئر. تُظهر هذه الصور أن العوامل المكونة للأوعية الدموية التي تفرزها الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الليفية للفئران قادرة على تحفيز تكوين الأنابيب.

بمرور الوقت، تهاجر الخلايا البطانية وتبدأ في تكوين تفرعات صغيرة خلال ساعة إلى ساعتين من الزرع. وتم الوصول إلى الحد الأقصى لتكوين الأنابيب خلال أربع إلى ست ساعات. وبحلول 24 ساعة، ظلت بعض التفرعات قائمة، ولكن العديد من الخلايا تعرضت للموت الخلوي المبرمج وبدأت الأنابيب في الانفصال.

يؤثر عدد الخلايا بشكل كبير على تكوين الأنابيب. فعندما يتم استزراع عدد غير كافٍ من الخلايا، تتشكل أنابيب قليلة وتكون الشبكة في حدها الأدنى، ومع زيادة عدد الخلايا المستزرعة، تصبح شبكة الأنابيب أكثر اتساعاً. ومع ذلك، عند التركيزات العالية جداً، تبدأ الخلايا في التكتل أو تكوين طبقات أحادية، مما يؤدي إلى حجب الفروق بين مجموعات المعالجة. لذا، يجب أن تمر الخلايا بمرحلتين (passages) من الممرات على الأقل لضمان تكوين أنابيب مناسبة.

إن معدل نمو خلايا B 11 سريع جداً لدرجة أن تمرير 25% من الخلايا في يوم واحد سيؤدي إلى الحصول على قارورة ذات طبقة خلوية متصلة في اليوم التالي. هنا، يتم استخدام برنامج image J مع ملحق angiogenesis على شبكة أنابيب مصبوغة بـ calcine AM للكشف عن إجمالي العقد، والأنابيب في الشبكة مجتمعة، والمدمجة في الشبكة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البرنامج للكشف بشكل فردي عن العقد، أو الأنابيب، أو الشبكة، والتي يمكن قياسها كمياً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء عملية تكوين الأوعية الدموية في المختبر (in vitro angiogenesis) بطريقة سريعة وموثوقة مع تجنب الأخطاء الشائعة.