A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مستويات الأسكوربات داخل الخلايا أو خارج الخلية في الخلايا المستنبتة أو المعزولة. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان مستخلصات الخلايا أو الخلايا الكاملة بدرجة أوكسيديز لاستنفاد درجة البكالوريوس بشكل انتقائي في الخطوات اللاحقة. في الطريقة الأولى ، يتم تحضين مستخلصات الخلايا بالسيانيد لتوليد سيانيد الحديد بطريقة تعتمد على الأسكوربات ، مما يعطي تمثيلا مباشرا لكمية الأسكوربات في المستخلصات.

بعد ذلك ، يتم تحديد كمية سيانيد الحديد المتكونة في مستخلصات الخلايا عن طريق أكسدة سيانيد الحديد كمي مع الحديد الحديديك المضاف لتشكيل حديد فيريس من أجل توليد مركب حديد فيرو ثنائي سرخس S الكروموجينيك الذي يمكن قياسه كميا طيفي ضوئي. في الطريقة الثانية ، يتم احتضان جميع الخلايا مباشرة مع الحديد اثنين من السرخس المخلب S وسيترات الحديديك. تظهر النتائج اختلافات في مستويات الأسكوربات داخل الخلايا أو خارج الخلية بناء على التخفيض الكمي والمحدد لمجمعات الحديد خارج الخلية التي يمكن اكتشافها.

الطيف متريا. الميزة الرئيسية للتقنية الحالية على الطرق الموجودة بالفعل مثل الكشف القائم على HBLC هي أنه يمكن إجراء اختبار الصفيحة الدقيقة عالي التحديد بسرعة كبيرة ويمكن معالجة جميع العينات والمعايير بالتوازي وليس بطريقة تسلسلية قبل بدء هذا الإجراء. ثقافة K 5 62 خلايا معلقة وإنشاء في درجة BA تحتوي على مستخلص خلوي.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مخزون من حمض الأسكوربيك 10 مللي مولار في PBS المثلج. ثم قم بإعداد سلسلة من معايير الأسكوربات بعناية بين صفر و 20 ميكرومولار. قم بإزالة أربعة حصص 100 ميكرولتر بعناية من كل معيار وأضفها إلى تسلسل أفقي من الآبار.

في صفيحة قاع مسطحة 96 بئر تحتوي على 25 ميكرولتر لكل بئر من PBS أو 45.5 وحدة لكل مليلتر. يغطي محلول مخزون L ascorbate oxidase أو AO في PBS لوحة البئر 96 برقائق معدنية ومدارية. امزجها على 550 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

عند الانتهاء ، أضف 50 ميكرولترا من 3.5 ملليمولار من سيانيد فيريس البوتاسيوم في PBS إلى جميع الآبار لإعطاء تركيز نهائي لسيانيد فيريس يبلغ ملليمولار واحد بعد الخلط المداري للوحة البئر 96 ، باستخدام نفس الظروف كما كان من قبل. أضف على الفور 25 ميكرولترا من محلول طازج يحتوي على 50٪ حمض الأسيتيك و 30٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول تحديد السيانيد الفرعوني المحضر حديثا إلى كل مدار بئر.

امزج الطبق في الظلام بسرعة 550 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اقرأ قيم امتصاص الآبار عند 593 نانومتر. لبدء الفحص.

أولا أكسدة الأسكوربات خارج الخلية في آبار مختارة عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من 120 وحدة لكل مليلتر AO أو HBSD إلى الآبار المقترنة في ثلاث نسخ لإعطاء تركيز AO نهائي يبلغ 10 وحدات لكل ملليلتر. بعد هذا التسمية ، يتم الآبار المزدوجة على أنها ناقص AO وبالإضافة إلى ao. بعد خلط الألواح بخلط مداري لطيف لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، أضف 50 ميكرولترا من 2.4 مللي مولار Ferne S إلى جميع الآبار لإعطاء تركيز نهائي للسرخس يبلغ 200 ميكرومولار ، امزج الألواح على النحو الوارد أعلاه لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من سترات الحديديك المحضرة حديثا 120 ميكرومولار إلى جميع الآبار لإعطاء تركيزات نهائية من الحديد والسترات من 10 ميكرومولار حديد و 50 ميكرومولار سترات على التوالي. تخلط جيدا في نهاية مقايسة الأسكوربات FLX. قم بشفط الوسط العلوي بسرعة من كل بئر وأضفه إلى الآبار ذات العلامات المناسبة في صفيحة 24 بئر.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة أجزاء ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة بئر 96 لتحديد الأسكوربات خارج الخلية. اقرأ قيم امتصاص الآبار عند 593 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي المجهري. أخيرا ، احسب كمية الأسكوربات خارج الخلية مثل م أسكوربات لكل مليغرام من البروتين الموضح.

فيما يلي منحنى قياسي نموذجي لمجموعة من معايير الأسكوربات ، من صفر إلى 20 ميكرومولار أو صفر إلى اثنين من أسكوربات NMO لكل بئر. من بين 96 لوحة بئر ، على الرغم من عدم عرضها هنا ، يتم الحفاظ على الخطية حتى ثمانية أسكوربات NMO لكل بئر ، وهو ما يتوافق مع عينة من تركيز الأسكوربات يبلغ حوالي 80 ميكرومولار. يمكن استخدام الاختبار للكشف بنجاح عن مستويات الأسكوربات التي تقل عن 0.25 أولي أسكوربات لكل بئر.

K 5 62 خلية تتراكم بسرعة الأسكوربات داخل الخلايا من حمض الأسكوربيك الديهيدرو L خارج الخلية ، ولكن ليس الأسكوربات. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحضين PBS المغسولة K 5 62 خلية في PBS مع 500 ميكرومولار من إما الأسكوربات ديهيدرو L حمض الأسكوربيك ديهيدرو L حمض الأسكوربيك بالإضافة إلى 50 ميكرومولار سيتو ب أسكوربات بالإضافة إلى خمسة مللي مولار سيانيد أو أسكوربات بالإضافة إلى 50 وحدة لكل مليلتر AO لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تحديد الأسكوربات داخل الخلايا كما هو موضح سابقا.

امتصاص حمض الأسكوربيك Dehydro L بواسطة K 5 يحدث 62 خلية عن طريق النقل الميسر لناقل الجلوكوز بوساطة الألوية لتقييم مشاركة الألوية في امتصاص حمض الأسكوربيك ديهيدرو إل. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحضين خلايا K 5 62 بتركيزات متزايدة من cyto B أو dihydro cyto B قبل الحضانة بحمض الأسكوربيك dehydro L. من المهم ملاحظة أنه في حين أن كلا من cyto callin B و dihydro cyto B يثبطان العمليات المتحركة بتركيزات ميكرومولار فقط cyto callin B ، والذي يختلف عن dihydro cyto B من خلال وجود رابطة مزدوجة واحدة تمنع النقل المعتمد على الألوية عند تركيزات منخفضة من الميكرومولار.

لذلك ، نظرا لأن ديهيدرو L تم تثبيط امتصاص حمض الأسكوربيك بواسطة cyto B مع IC 50 أقل من 2.5 ميكرومولار ، ولكن لم يتم تثبيطه بواسطة ثنائي هيدرو سيتو. ب ديهيدرو. من المحتمل أن يحدث امتصاص حمض الأسكوربيك عن طريق النقل بوساطة الألوية.

بدلا من ذلك ، تعرضت الخلايا المغسولة لتركيزات متزايدة من جلوكوز الألوية القابلة للنقل ، ولكن غير القابلة للتمثيل الغذائي ثلاثة ميثيل D جلوكوز أو أيزومر ستيريو الجلوكوز غير القابل للنقل L الجلوكوز أثناء الحضانة مع حمض الأسكوربيك ديهيدرو إل. مرة أخرى ، تشير النتائج إلى تورط glu في استيراد حمض الأسكوربيك ديهيدرو L حيث يحدث تثبيط تراكم الأسكوربات داخل الخلايا فقط في وجود نظير الجلوكوز القابل للنقل. في الاختبار الثاني.

يمكن تحديد معدل تدفق الأسكوربات من الخلايا المستنبتة. هذا الاختبار المحدد مهم حيث يبدو أن إطلاق الأسكوربات من الخلايا أمر بالغ الأهمية لامتصاص الخلايا المنظم للأسكوربات للحديد غير المرتبط بالترانسفيرين. يعتبر امتصاص الحديد غير المرتبط بالترانسفيرين ذا صلة بالفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات الحمل الزائد للحديد ، مثل داء ترسب الأصبغة الدموية ، وكذلك تبادل الحديد في الخلايا العصبية النجمية والتوازن في دماغ الثدييات.

في الواقع ، يؤدي الناقل العصبي المثير الرئيسي L glutamate إلى إطلاق الأسكوربات للخلايا النجمية بطريقة تعتمد على L glutamate ، والامتصاص بالزجاج ، وربما GLT واحد والتورم الخلوي اللاحق الذي يؤدي إلى إطلاق الأسكوربات بواسطة VSOs المفترضة. قياسا على ذلك ، يمكن تحفيز إطلاق الدرجة A من الخلايا النجمية المحملة بدرجة B بواسطة الحمض الأميني المثير L aspartate ، ولكن ليس الحمض الأميني غير المثير L الجلوتامين. تم تصوير هذا التأثير هنا ، والذي يوضح منحنيات استجابة الجرعة لتحفيز إطلاق الأسكوربات بواسطة الأسبارتات والجلوتامين من الثقافات الأولية للخلايا النجمية المحملة بالأسكوربات بمجرد إتقانها.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.