إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

وقد وضعت لدينا مختبر بولي أكريلاميد الهلاميات المائية crosslinked-DNA، ونظام هيدروجيل دينامية، لفهم أفضل للآثار تصلب الأنسجة تحوير على وظيفة الخلية. هنا، ونحن نقدم الخطط، والأوصاف، وبروتوكولات لإعداد هذه الهلاميات المائية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد الهلاميات المائية متعددة الأكريلاميد المتشابكة بالحمض النووي والتي يمكن أن تصلب أو تليين عن طريق سحب الحمض النووي أحادي الجدول في وسط الثقافة بعد طلاء الخلايا في الأعلى. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعليق Resus الأول SA المجفف بالتجميد واحد ، SA اثنين L two R two ، والتحكم في الحمض النووي أحادي الشريطة في المخزن المؤقت وبلمرة محللين SA one و SA بشكل فردي في العمود الفقري من أكريلاميد بولي أكريلاميد. الخطوة الثانية هي خلط المحاليل المبلمرة SA one و SA مع محلول L two لتشكيل هلام الحمض النووي.

بعد ذلك ، يتم تثبيت محلول هلام الحمض النووي على زلات الغطاء الزجاجي بالغراء البصري. الخطوة الأخيرة هي تشغيل المواد الهلامية عن طريق معالجتها ب sul sampa ثم PDL. في النهاية ، يتم طلاء الخلايا على المواد الهلامية للحمض النووي ويتم تعديل مرونة الهلام بإضافة R two L two أو التحكم في الحمض النووي أحادي الجدول لتليين أو تصلب أو عدم تغيير مرونة الهلام على التوالي.

تظهر نتائج هذه التجارب أن الطبيعة الديناميكية للركيزة الأساسية مباشرة سلوك الخلية ، وتتمثل ميزة استخدام هذه التقنية على الطرق الأخرى مثل CROs ، واللغة ، والهيدروجيل الكروي ، في أن المواد الهلامية للحمض النووي لا تتطلب حافزا مثل الأشعة فوق البنفسجية لتعديل مرونتها. بدلا من ذلك ، يتم تقوية المواد الهلامية للحمض النووي وتنعيمها عن طريق انتشار L two أو R two ، الحمض النووي أحادي الشريطة من خلال الهلام على التوالي. أول جهاز طرد مركزي مجفف بالتجميد SA واحد مجفف واحد في 2000 GS لمدة 15 ثانية للتأكد من أن كل الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل موجود في الجزء السفلي من الأنبوب.

بعد الطرد المركزي ، قم بإعداد ثلاثة مللي مولار من محلول SA واحد عن طريق إضافة 107 ميكرولتر من واحد × تريس أو EDTA أو TE إلى الأنبوب قم بتسخين المخزن المؤقت SA one NTE عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى يتم إذابة حبيبات الحمض النووي المفردة التي تقطعت بهم السبل تماما. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مبلمر SA واحد عن طريق إضافة 45 ميكرولترا من 40٪ أكريلاميد و 18 ميكرولترا من 10 × عازلة تريبو أو EDTA أو TBE وأجهزة طرد مركزي. هذا الخليط لتسهيل الخلط.

أدخل طرفا من P 200 ، وقم بتوصيله بمصدر غاز النيتروجين في المحلول واترك غاز النيتروجين يمر ببطء عبر المحلول لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 ثانية عند 2000 Gs لجمع المحلول عند الانتهاء من 4.5 ميكرولتر من 2٪ أمونيوم لكل كبريتات أو PS إلى العينة لبدء بلمرة الهلام ، اقلب الأنبوب عدة مرات للخلط بعد الطرد المركزي للعينة لجمع محلول البلمرة المتجانسة ، أضف 4.5 ميكرولتر من 20٪ رباعي إيثيل الميثيلين ، ديامين ، أو مثبتة على العينة لتحفيز البلمرة بمجرد خضوع العينة ، الخلط والطرد المركزي. قم بتفريغ المحلول بغاز النيتروجين لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لإكمال البلمرة وتقليل المونومرات غير التفاعلية.

بعد ذلك ، احتضان المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإكمال البلمرة وتوفير محلول مبلمر SA واحد. كرر الخطوات السابقة مع SA المجفف بالتجميد ، واثنين من الحمض النووي أحادي الشريطة ، مع إضافة 45 و 18 و 4 و 0.5 و 4.5 ميكرولتر من مادة الأكريلاميد T-B-E-A-P-S والضغط على التوالي إلى 108 ميكرولتر من محلول SA الثاني. لتحضير L two R two وحلول التحكم ، وأجهزة الطرد المركزي ، المجففة بالتجميد ، والحمض النووي أحادي الجدول وإضافة الكميات التالية من المخزن المؤقت TE إلى الحمض النووي أحادي الشريطة المجفف بالتجميد المقابل كما هو موضح سابقا ، قم بتسخين المحلول حتى يذوب لمحلول الجل.

المستحضرات بتسخين المحاليل المبلمرة sa one و SA على حرارة 70 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة تقريبا. حتى يتم تقليل لزوجة المحلول. أضف 10 ميكرولتر أو 10 أجزاء من محلول SA المبلمر إلى 10 ميكرولتر أو 10 أجزاء من محلول SA المبلمر.

ثم امزج المحاللين المبلمرين SA one و SA معا عن طريق التسخين بالتناوب لمدة 15 ثانية عند 70 درجة مئوية مع التقليب لمدة 15 ثانية باستخدام طرف ماصة لمدة دقيقة واحدة. بعد الخلط في ستة ميكرولتر أو ستة أجزاء من 100٪ L محلول اثنين لتشكيل هلام 100٪. بمجرد خلط العينة كما هو موضح سابقا ، قم بتقطيع الماصة بنسبة 100٪ من الجل في طبق بتري مقاس 60 ملم وقم بتسخين الجل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة التلدين المثلى.

بعد ذلك ، اسمح للروابط المتشابكة للحمض النووي بالاستمرار في إعادة التهجين عن طريق احتضان المواد الهلامية لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية الجل ب PBS الذي يحتوي على الكالسيوم في المغنيسيوم بعد الحضانة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي من طبق بتري وضع الجل في أنبوب طرد مركزي دقيق. في هذه المرحلة ، قم بتسخين الجل بنسبة 100٪ على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح الجل أقل لزوجة.

لسحب العينات، ضع الغطاء الزجاجي على كتلة حرارية 70 درجة مئوية واتركه يسخن لمدة دقيقة إلى دقيقتين. أضف قطرة من المادة اللاصقة البصرية إلى كل زلة غطاء زجاجي. ثم أضف 20 ميكرولترا من الجل بنسبة 100٪ إلى كل زلة غطاء زجاجي ، واترك الجل يذوب وينتشر فوقها.

قم بإزالة كل كوب يحتوي على جل من كتلة الحرارة وضعه في طبق زراعة أنسجة 24 جيدا. قم بتعريض المواد الهلامية لضوء الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة 15 دقيقة. بعد تسخين الجل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الشرج المثلى والسماح للروابط المتشابكة للحمض النووي بإعادة التهجين لمدة أربع ساعات ، أضف PBS إليها.

ثم احتضان المواد الهلامية طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الآبار باستخدام ماصة مع الحرص على عدم شفط الجل. ثم أضف سلفا سامبا لتغطية كل جل.

بمجرد أن تتعرض المواد الهلامية لضوء الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة السلفا سامبا. اشطف المواد الهلامية مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة طبقة السلفا سامبا الزائدة بعد تكرار الخطوات السابقة ، واحتضن المواد الهلامية في حوالي 300 ميكرولتر من 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من بولي دي ليسين طوال الليل عند أربع درجات مئوية عند الانتهاء ، اغسل المواد الهلامية مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لإزالة البولي يسين الزائد وإضافة الوسائط. بمجرد احتضان المواد الهلامية في الوسائط لمدة 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسائط مباشرة قبل طلاء الخلايا لزراعة الخلايا وتصويرها.

الليفية التي نمت على المواد الهلامية المتصلبة ، لم يكن لها أي تغييرات في نسبة العرض إلى الارتفاع ، ولكنها أظهرت مساحة إسقاط أكبر من الخلايا الليفية المزروعة على المواد الهلامية بنسبة 100٪. الخلايا الليفية المزروعة على 100٪ من المواد الهلامية كان لها مساحة إسقاط أصغر ونسبة عرض إلى ارتفاع أكبر من الخلايا الليفية المزروعة على 80٪ من المواد الهلامية. تشير هذه النتائج إلى أن سلوك الخلايا الليفية يعتمد على الطبيعة الديناميكية للبيئة المكروية.

يكن لدى الخلايا العصبية المزروعة على المواد الهلامية الملينة أي اختلافات في عدد التغصنات الأولية أو طول المحور العصبي ، ولكنها أظهرت التشعبات الأولية الأقصر من الخلايا العصبية المزروعة على المواد الهلامية بنسبة 50٪. كما هو الحال في دراسات الخلايا الليفية ، كانت الأنماط الظاهرية العصبية على المواد الهلامية الثابتة مختلفة عن الأنماط الظاهرية العصبية على المواد الهلامية الديناميكية. تحتوي الخلايا العصبية المزروعة على 50٪ من المواد الهلامية على عدد أقل من التشعبات الأولية والمحاور الأطول من الخلايا العصبية المزروعة على المواد الهلامية بنسبة 100٪.

أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم للغاية أن تتذكر ماصة الجل اللزج بدقة، نظرا لأن التركيزات مهمة في تجنب انفجار الهلام، فقد يستغرق سحب العينات الدقيق عدة محاولات، ونحن نقدم العديد من الخيارات الأخرى في جزء المناقشة من هذا البروتوكول.