التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

الهدف من هذا الإجراء هو إظهار كيفية تنفيذ الفحص المجهري الفلوري الكلي للانعكاس الداخلي القائم على الاستقطاب لدراسة إعادة تشكيل الغشاء أثناء إفراز الخلايا المنظم. يتم تحقيق ذلك من خلال التأكد أولا من وضع العناصر البصرية ، وهي لوحة الموجة الرباعية والمكعبات المستقطبة بشكل صحيح لتوليد استقطابات إثارة منفصلة p و s. الخطوة الثانية هي التحقق من أن الحزم p و s عبارة عن كولين يمر عبر المحور البصري للمجهر ويضيء نفس الجزء من مجال الرؤية عندما يكون في انعكاس داخلي كلي أو مضان أو TIRF.

بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا المراد تصويرها بموت سيانيد الكربو، ويموت D ويتم تحفيزها بمحفزات مزيلة للاستقطاب لتحفيز إفراز الخلايا. الخطوة الأخيرة هي التقاط صور لدمج الحويصلات الأساسية الكثيفة أثناء وجودك في TIRF. في النهاية ، يتم استخدام P-T-I-R-F للحصول على الصور في الوقت الفعلي لمراقبة التغيرات الطوبولوجية للغشاء الناتجة عن إفراز الخلايا الخلوية لخلايا الكرومين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قياس الحرارة والسعة الغشائية ، هي أن ptro F يبلغ عن انحناء الغشاء وبالتالي تمدد منفذ الاندماج مباشرة. الجزء الأكثر انحدارا في منحنى التعلم باستخدام هذه التقنية هو تعلم أولا محاذاة استقطابات الإثارة p و s ، بحيث تنتقل الكولين عبر المحور البصري للمجهر وتضيء نفس الجزء من مجال التصوير. تتعلق القضية الثانية التي تنشأ غالبا بتلوين الخلايا ، وهي المدة التي تستغرقها تعريض الخلايا ل dd وما الذي يشكل خلية ملطخة جيدا مقابل خلية ملطخة بشكل سيئ.

عرض الإجراء هو TA square row ، طالب دراسات عليا من مختبرنا. لبدء التشغيل على جميع مكونات المجهر ، تقوم أجهزة الليزر وأجهزة الكمبيوتر بتوجيه شعاع من الليزر 488 نانومتر إلى المستوى البؤري الخلفي لعدسة الفتحة العددية 1.49. إذا كان شعاع الليزر مركزا على المستوى البؤري الخلفي ، فسوف يظهر ويجمع ويظهر كبقعة صغيرة محددة جيدا على السقف فوق الهدف مباشرة.

ثم اضبط مرآة الجلفانومتر X بحيث يتم تحريك شعاع الليزر بعيدا عن المحور ويخرج من الهدف بزوايا أكثر انحدارا تدريجيا إلى الوضع الطبيعي الموضوعي. بعد ذلك ، تحقق من تحقيق الانعكاس الداخلي الكلي أو النقل البري الدولي. أضف 10 ميكرولترات من الكريات المجهرية الفلورية إلى حجم مليلتر واحد من المحلول الملحي الفسيولوجي وطبق زجاجي سفلي ، يجب اكتشاف التألق فقط من الكريات المجهرية الموجودة في الجزء السفلي من الطبق الأقرب إلى واجهة TIR.

يشير اكتشاف الكريات المجهرية العائمة إلى أن الزاوية بين الضوء الساقط والموضوعي الطبيعي غير كافية. للتصوير القائم على الاستقطاب ، استخدم شعاع 488 نانومتر المحاذاة كدليل واضبط موضع شعاع الليزر الخام 561 نانومتر بحيث يتحرك على طول مسار بصري متطابق. سيتم استخدام الليزر 561 نانومتر لتصوير صبغة كاربو سيانيد.

توجد عدسة ومرايا متباينة في اتجاه مجرى الليزر 561 نانومتر. باستخدام مقابض الضبط الموجودة على المرايا ، اضبط الشعاع بحيث يتماشى مع شعاع 488 نانومتر وتكون البقعة في بؤرة التركيز على السقف. عندما تكون مرايا الجلفانومتر في وضع الصفر ، يعكس مكعب الاستقطاب المكون الرأسي للمجال الكهربائي ويمر بالمكون الأفقي.

يتم وضعه في اتجاه مجرى الشعاع المستقطب بيضاوي الشكل على مرحلة ترجمة صغيرة. لتسهيل المحاذاة اللاحقة للاستقطاب ، تستخدم مسارات الحزمة مكعبا استقطابا ثانيا ومرايا لإعادة تجميع الحزم. يتم وضع مصراع بين مكعب الاستقطاب الأول ومرآة المكون الرأسي.

يتم وضع غالق ثان بين مرآة المكون الأفقي ومكعب الاستقطاب الثاني. يتم التحكم في هذه المصاريع بواسطة برنامج التصوير مما يتيح للمستخدم الاختيار بسرعة بين استقطابات الحزمة. استخدم مرشح استقطاب للتحقق من اتجاه المجال الكهربائي في كل مسار حزمة.

سيسمح مرشح الاستقطاب فقط بالإرسال بما يتماشى مع محور المرشح. تحقق من محاذاة المكونات الرأسية والأفقية لشعاع الليزر مع بعضها البعض ومع شعاع 488 نانومتر ، قم بإجراء التعديلات حسب الضرورة. يجب أن تركز جميع الحزم الثلاثة على المستوى البؤري الخلفي وتخرج مرتبة من الهدف إلى نفس البقعة على السقف.

يمكن تمييز هذه البقعة بعلامة X لتسهيل المحاذاة المستقبلية. بعد ذلك ، ضع قطرة من زيت الغمر على الهدف. ضع الطبق الذي يحتوي على كريات مجهرية فلورية.

في الهدف ، أدخل TIR عن طريق تحريك مرآة الجلفانومتر X في برنامج تحريك المرآة في TIR. المكون الرأسي للحزمة هو الاستقطاب S والمكون الأفقي للحزمة هو الآن مركز الاستقطاب P أو لوحة ربع الموجة أو qw في مسار الحزمة. مباشرة في اتجاه مجرى فتحة الليزر ، شاهد كل حقل زائل مستقطب مع عينة قضيب دومين ، والتي من المتوقع أن تكون موجهة بشكل عشوائي.

قم بتدوير لوحة qw لتتناسب مع متوسط شدة البكسل. اعزل خلايا الكرومين السليمة من الغدة الكظرية للقطط كما هو موضح في بروتوكول النص ، وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، واستعد للخلايا الشفافة مع ترميز الحمض النووي للبروتين محل الاهتمام باستخدام نظام التثقيب الكهربائي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. الإعدادات التي توفر أفضل توازن بين كفاءة التعداء ومعدل بقاء الخلية.

لهذا التحضير لخلايا الكرومين البقري هي 1 ، 100 فولت ، 40 مللي ثانية ، ونبضة واحدة تتبع خلايا لوحة التعداء برفق على أطباق بولي دي ليسين والكولاجين المعالجة في مليلتر واحد من وسائط العرض الكهربائي الدافئة. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية. أضف ملليلترا واحدا من وسائط المضادات الحيوية إلى كل طبق بعد ست ساعات ، قم بتغيير الوسائط إلى الوسائط العادية في اليوم التالي.

عادة ما يتم تصوير خلايا الكرومين بعد 48 ساعة إلى خمسة أيام من التثقيب الكهربائي باستخدام نظام التصوير عند بدء برنامج الاستحواذ. تحقق من محاذاة الليزر. تحقق من ملف تعريف المجال الزائل باستخدام الكريات المجهرية.

إعداد نظام الوفرة العالمي والمحلي. نظف خزانات المحلول بالماء منزوع الأيونات المصفى واملأه بالمحاليل الملحية القاعدية والمحفزة. قبل تصوير خلايا الكرومين ، تحقق من أن الاستقطاب P وإثارة الاستقطاب S يضيئان نفس المنطقة من مجال العرض وأن شدة الإضاءة مكافئة تقريبا كما هو مفصل في بروتوكول النص.

انتقل الآن إلى تلطيخ خلايا الصفاء البقرية باستخدام DD.اشطف وسائط الثقافة من الطبق الذي يحتوي على خلايا الكرومين واستبدلها بملليلترين من محلول ملحي فسيولوجي قاعدي. أضف 10 ميكرولتر من 10 ملليمولار DD مباشرة إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا. حرك الطبق برفق لمدة ثانيتين إلى 10 ثوان قبل إزالة المحلول.

اغسل الطبق ثلاث إلى أربع مرات بمحلول ملحي فسيولوجي أساسي لإزالة أي DD متبقي ، فالخلايا الآن ملطخة وجاهزة للاستخدام. أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف. ضع الطبق الذي يحتوي على خلايا الكرومين الملطخة ب Dai D فوق الهدف.

ضع إبرة التروية المحلية بحيث تكون على بعد 100 ميكرون تقريبا من الخلية. ركز على غشاء الخلية وقم بتنشيط جهاز التركيز التلقائي مباشرة قبل الحصول على صورة تحفيز الخلية. ابدأ في الحصول على الصور في خلايا النفخ لمدة 10 ثوان بمحلول قاعدي ، ثم لمدة 60 ثانية بمحلول كلوريد البوتاسيوم مزيل للاستقطاب 56 مللي مولار.

الحصول على صور أثناء الإغلاق السريع بين 561 نانومتر P الاستقطاب والاستقطاب 561 نانومتر ثانية لمراقبة التغيرات في انبعاثات p و s من DD و 488 نانومتر الإثارة. لتصوير مسبار الحويصلة المنقولة ، يتم تحقيق وضع العلامات الغشائية الغزيرة لخلايا الكروم بعد حضانة قصيرة مع داي D.In هذا المثال ، يتم تلطيخ غشاء الخلية جيدا. ستظهر الخلية الملتصقة السليمة اختلافات واضحة في انبعاثات p و s.

تظهر صورة انبعاث P حدود خلية أكثر إشراقا فيما يتعلق ببقية الخلية. تظهر صورة الانبعاث S تألقا موحدا تقريبا عبر بصمة الخلية ، محسوبا بكسل إلى بكسل P على S و p زائد ثانين. الصور حساسة لانحناء الغشاء وتركيز الصبغة على التوالي.

تم نقل CHRO والخلية الموضحة مع المشبك OIN فلورين واحد لتسمية الحويصلات الإفرازية. يتم تحفيز CHRO والخلية بكلوريد البوتاسيوم لإزالة استقطاب غشاء الخلية وتحفيز إفراز الخلايا. يظهر عدد من البقع الفلورية الصحيحة فجأة مع اندماج الحويصلات الأساسية الكثيفة.

يتم رسم مربع أبيض حول حدث اندماج واحد لتحليل هذا الحدث الاندماج إطارا تلو الآخر ، تم فحص تغييرات الإطار تلو الآخر في الجلوس ، تم فحص شدة صورة فلورين بو VS و p بالإضافة إلى شدة صورة ثانية. تتضاءل شدة الفلورسنت الفلورية ل CIT One بسرعة حيث ينتشر البروتين بعيدا عن موقع الاندماج. تتضاءل المسافة البادئة التي تمثل مركب غشاء البلازما الحويصلية المنصهرة بمعدل أبطأ نسبيا.

يصور هذا الرسم التوضيحي تفسيرا واحدا لهذه القياسات. يتسبب تشوه الغشاء السريع والموضعي في تدفق الكالسيوم الناجم عن التحفيز ، مما يؤدي إلى زيادة كبيرة في مضان G Camp 5G مما يدل على زيادة في مستويات الكالسيوم تحت البلازمية. يتم تحديد منطقة 30 × 20 بكسل للخلية وتغييرات إطارا تلو الآخر في G camp 5G PS و p زائد ثانيين.

يتم عرض شدة البكسل في الصور والرسوم البيانية. يحدد الضرب صفر الإطار قبل أن يكون التغيير في PS واضحا. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى أن تشوه الغشاء مصحوب بانخفاض في p زائد انبعاث اثنين من S.

يتم استبعاد بروتين العصارة الخلوية G CAMP 5G من المنطقة بواسطة الحويصلة الأساسية الكثيفة المنصهرة. لاحظ أيضا الانخفاض المفاجئ في كثافة 5G في معسكر G في بعض الأحيان صفر. تشير الزيادة طويلة العمر في نقاط البيع والانخفاض في p زائد ثانيتين إلى وجود مسام اندماج تتسع ببطء كما هو موضح.

هنا بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء نظام PTU F وخلايا الصورة لمراقبة التغيرات الطوبولوجية للغشاء أثناء وجودك في العشب بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف التغيرات في شكل الغشاء أثناء إفراز القام الخلوي ، والحركة الخلوية ، وحركة الخلايا في الخلايا الحية.