خارج الخلية سلك Tetrode تسجيل في الدماغ من المشي بحرية الحشرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل النشاط العصبي المعقد في الدماغ وتنسيقه مع السلوكيات المسجلة بالفيديو للحشرات التي تتحرك بحرية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع أقطاب تسجيل مرنة من أسلاك دقيقة للغاية، مع شحذ الطرف واختباره وطلائه، واستخدام مادة لتحديد موقعه وتثبيت السلك في أنابيب البولي إيثيلين. وتتمثل الخطوة الثانية في إدخال قطب التسجيل في الدماغ، وتثبيته باستخدام الأسيتات والشمع، وتثبيت حلقة تخفيف الإجهاد على الرأس.

بعد ذلك، يتم تسجيل النشاط العصبي بالتزامن مع تسجيل فيديو لسلوك الحركة. قم بمزامنة الفيديو مع التسجيل عن طريق نبضة مزامنة إلى صمام ثنائي باعث للضوء (LED) والمضخم. وتتمثل الخطوة النهائية في ترسيب النحاس باستخدام تيار كهربائي مستمر وتكثيف الصبغ باستخدام طريقة Tims لتصور موقع التسجيل.

وفي نهاية المطاف، تتيح تقنيات الفرز خارج الخلوي متعدد الوحدات عالي الكثافة تحديد الوحدات العصبية، بينما يسمح تحليل الفيديو المسجل بالتزامن للسلوكيات بإيجاد ارتباط دقيق المقياس بين النشاط العصبي والسلوك. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح لنا استخدام الإجراءات الحالية لتسجيل النشاط العصبي خارج الخلوي عالي الكثافة من دماغ الحشرة أثناء قيامها بسلوك معقد. كما تتيح لنا تحديد موقع أسلاك Tet في الدماغ، ويمكن تنفيذ كل ذلك بتكلفة منخفضة نسبياً.

يمكن لهذه التقنية أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأمراض العصبية من خلال ربط توقيت وكثافة النشاط العصبي في مناطق محددة من الدماغ بسلوك حيوان يتحرك بحرية. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول التحكم الحسي الحركي، كما يمكن تطبيقها أيضاً على أي سلوكيات تتطلب تحرك الحشرة بحرية، مثل تعلم التوجه أو الملاحة. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذا المجال صعوبة لأن أقطاب التسجيل الكهربائية يصعب التعامل معها، كما أن وضعها وتثبيتها من أجل التسجيل يتطلب تقنيات جراحية مجهرية دقيقة للغاية.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية. إن إجراءات تصنيع وزرع الـ Tero صعبة التعلم لأنها تُنفذ باستخدام مواد صغيرة جداً وهشة، ويجب توخي الحذر الشديد لتجنب إتلاف أنسجة الدماغ. لتحضير أسلاك Tet Road، ضع سلكين من أسلاك rom المسحوبة في جهاز لف دوار يعمل بمحرك.

قم بلف الـ tero في اتجاه واحد لمدة دقيقتين بمعدل 60 دورة في الدقيقة، ثم قم بفكه في الاتجاه المعاكس لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، استخدم مسدس حراري لصهر الأسلاك معاً، مع الحرص على عدم ملامسة الأسلاك بالمسدس. قم بإجراء ثلاث تمريرات صعوداً وهبوطاً من اتجاهات متبادلة، بحيث تستغرق كل تمريرة حوالي 10 ثوانٍ.

ثم أضف أنبوب دعم مصنوعاً من أنبوب بولي إيثيلين بطول 30 سنتيمتر. مرر سلك التيترا ببطء داخل أنبوب الدعم لضمان عدم التوائه. وبمجرد ظهور الطرف المدمج عند الطرف الآخر من الأنبوب، اسحبه بحيث يكون هناك طول متساوٍ من السلك عند كلا طرفي أنبوب التوجيه.

الآن، أمسك الطرف المنفصل من كل سلك باستخدام الملقط مستعيناً بقاعدة لهب موقد الغاز. قم بحرق المادة العازلة بعناية من آخر 2 أو 3 مليمترات من كل سلك. سخّن السلك حتى يتوهج دون أن يلتوي.

بعد ذلك، استخدم ملقطاً لتوصيل الـ tero بمحول مقبس IC (ذكر-أنثى) يتوافق مع جهاز التسجيل. ضع الطرف غير المعزول لكل سلك في مقبس مختلف من المحول. أضف دبوساً نحاسياً للمساعدة في تثبيت الأسلاك في مكانها.

استخدم بعد ذلك مكواة لحام ذات سن دقيق لملء المقبس بالقصدير المذاب. ثم اختبر التوصيلات الكهربائية للتأكد من سلامتها باستخدام مقياس المعاوقة كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. وباستخدام محول منفصل غير مستخدم، قم بتشكيل قالب ورقي صغير به ثقوب في الأسفل.

بالنسبة للدبابيس الذكرية، انقل المهايئ العامل إلى الصندوق بحيث يكون الجانب الذكري في الأسفل والدبابيس بارزة من الصندوق. بعد لصق الصندوق بالشريط اللاصق كما هو موضح في البروتوكول النصي، اخلط مادة الإيبوكسي ثنائية المكونات بسرعة، ثم صبها في الصندوق.

لتثبيت المهايئ وجميع الأسلاك، قم بتثبيت الطرف القريب من أنبوب التوجيه على أحد جانبي الصندوق باستخدام شمع الأسنان، مع ترك الأنبوب مفتوحاً بحيث يمكن سحب سلك الـ tero بحرية من كلا الطرفين. بعد تصلب الإيبوكسي وجفاف المجموعة بالكامل، تتمثل الخطوة التالية في شحذ الـ tero. ابدأ بقطع طرف الـ tero باستخدام شفرة مشرط حادة.

بعد ذلك، قم بتلميع الـ tero باستخدام أداة دوارة صغيرة مثبتة رأسيًا مع أقراص صنفرة متوسطة وناعمة الحبيبات. اضبط الأداة الدوارة لتدور بسرعة متوسطة مع إمساك الحزمة بالقرب من طرفها. وباستخدام الملقط، قم بإمالة الطرف المثبت بالسلك بزاوية 45 درجة بالنسبة لقرص الصنفرة.

من الضروري أن يكون اتجاه دوران أقراص الصنفرة بعيداً عن الزاوية الضحلة لنهايات الأسلاك، وإلا فقد يحدث انفصال في الأسلاك. لامس الحزمة برفق بقرص الصنفرة متوسط الحبيبات لمدة ثانية إلى ثانيتين، ثم لامس قرص الصنفرة ناعم الحبيبات لمدة ثانية إلى ثانيتين إضافيتين.

كرر هذه العملية ثلاث مرات أخرى، مع تدوير الحزمة محورياً بمقدار 90 درجة في كل مرة. عند الانتهاء، استخدم مجهراً تشريحياً للتحقق من أن نهاية الحزمة ذات طرف مدبب مع إزالة كميات صغيرة من العازل من نهاية كل سلك، ومن عدم وجود أي تنسل. يتم ذلك بعد إعادة فحص المعاوقات بين الأسلاك الفردية وبين كل سلك ولوحة التأريض.

قم بطلاء السلك الأول بتيار قدره 2.5 microamps عن طريق وضع طرفه في محلول كبريتات النحاس المشبع. وباستخدام عازل للمنبهات، قم بحقن التيار لمدة ثانية واحدة. انتظر لمدة ثانية واحدة ثم كرر هذه العملية ثلاث مرات.

ثم قم بطلاء الأسلاك الثلاثة المتبقية بنفس الطريقة. وبعد ذلك، تحقق من المعاوقة مرة أخرى. قم بتركيب المهايئ على مرحلة الرأس الخاصة بنظام تسجيل متعدد القنوات.

ثبّت دبوس حشرات مثنيًا في جهاز تحريك دقيق، ثم ثبّت طرف سلك tero بالدبوس باستخدام شمع الأسنان بعد تخدير صرصور وتثبيته كما هو موضح في البروتوكول النصي؛ استخدم شفرة حلاقة لعمل فتحة صغيرة بين عيون الخلية O بعد إزالة القشيرة. استخدم ملقطًا لإزالة الأنسجة الضامة والدهون لكشف الدماغ. بعد ذلك، ضع محلول ملحي خاص بالصراصير داخل كبسولة الرأس لتغطية أنسجة الدماغ من أجل إزالة الغمد عن الدماغ.

استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك برفق بالغشاء الموجود فوق الدماغ، واستخدم ملقطاً دقيقاً آخر لتمزيق الغشاء في المنطقة التي تم فيها زرع الأسلاك. بعد ذلك، استخدم دبوس حشرات لفتح ثقب صغير في كبسولة الرأس أمام الدماغ. أدخل ضفيرة مكونة من 3 أسلاك نحاسية معزولة بقطر 56 micron في الثقب.

لتعمل كقطب أرضي مرجعي، قم بخفض طرف التت رود (tetrode) إلى سطح الدماغ باستخدام الميكرو مانيبوليتور (micro manipulator) وثبته بالقرب من المنطقة المستهدفة. ضع بعناية قطعتين صغيرتين من رقاقة أسيتات رقيقة بمقاس 2×1 ملم، بحيث تكون أكبر قليلاً من الفتحة الموجودة في كبسولة الرأس، وذلك في الجهتين الأمامية والخلفية للتت رود (tetrode).

اخفض مسبار tede ببطء إلى مسافة تتراوح بين 150 و250 ميكرون تحت سطح الدماغ مع مراقبة جودة التسجيل. ابحث عن نبضات خارج خلوية تلقائية متوسطة إلى كبيرة الحجم للإشارة إلى كل من المنطقة ذات الأهمية والحيوية العامة للأنسجة العصبية. عند الرضا عن موقع Tero، حرك قطعتي ورقة الأسيتات لتكونا أقرب ما يمكن من tetro دون لمسه.

من المهم جداً توخي الحذر الشديد أثناء التشريح والزرع لتجنب تمزيق الأسلاك. باستخدام ملعقة صغيرة مُصنعة عن طريق تسطيح طرف إبرة تحت الجلد، قم بتسخين الملعقة باستخدام موقد كحولي، ثم ضع الملعقة في شمع الأسنان بحيث يتواجد شمع سائل عند طرف الملعقة.

لامس الشمع السائل بعناية طرف ورقة الأسيتات الأبعد عن الـ tero، مما يسمح للشمع السائل بسد الفجوة بين ورقة الأسيتات والكيوتيكل الرأسي. استمر في إعادة تسخين الملعقة الملوكية (spatula) ووضع كمية صغيرة من الشمع السائل على ورقة الأسيتات. تحرك تدريجيًا نحو الـ tero ثم قم بتثبيته في النهاية بكمية صغيرة من شمع الأسنان.

تجنب وصول الشمع الساخن إلى التجويف أو فوق الدماغ. بعد ذلك، قم بتثبيت القطب المرجعي باستخدام الشمع بطريقة مماثلة. الآن، قم بتسخين الشمع الذي يربط tero بالمحرك الدقيق (micromanipulator) لتحرير tero منه.

بعد ذلك، قم بلف السلك (tero) داخل الشمع الموجود على الرأس لتوفير تخفيف للإجهاد، ثم غطِ حلقة تخفيف الإجهاد بالشمع. في هذه المرحلة، قم بإزالة القيود بعناية وانقل العينة إلى طبق بتري موضوع على الثلج. ثبت العينة بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى باستخدام دبابيس تثبيت كبيرة. وباستخدام مسدس غراء، قم بتثبيت عود خشبي بحيث يمتد من منطقة pro noum فوق البطن.

بعد ذلك، قم بتثبيت طرف أنبوب tero بالنهاية الخلفية للقضيب باستخدام شمع الأسنان. ثم قم بتثبيت tero والقطب المرجعي بالنهاية الأمامية للقضيب باستخدام شمع الأسنان. ثم اسحب tero من طرف مقبس الأنبوب قدر الإمكان، ولكن تجنب شده بقوة.

ثبته بالمحول باستخدام الشمع للقضاء على احتمال قيام الحيوان بإتلاف الجزء المكشوف من الـ tero. بعد إزالة جميع القيود، قم بتوصيل القطب المرجعي بأنبوب الـ tero باستخدام شمع الأسنان. قم بإجراء تسجيلات عصبية ومرئية جيدة كما هو موضح في البروتوكول النصي قبل البدء في التجارب السلوكية؛ بالنسبة لتجارب المشي، اسمح للصرصور باستكشاف ساحة من البلكسي جلاس، وبالنسبة لتجارب التسلق، اسمح له باستكشاف ساحة من البلكسي جلاس.

استخدم ساحة طويلة وضيقة تحتوي إما على عائق على شكل رف ليتسلقه الحيوان أو يمر من تحته، أو كتلة من البليكسي جلاس ليتسلقها الحيوان. عند التسجيل، قم بتوليد نبضة TTL من الكمبيوتر باستخدام أمر MATLAB مخصص. تولد نبضة TTL طابعاً زمنياً لنظام التسجيل وتقوم إما بتشغيل أو إيقاف ضوء LED لتجارب التحفيز.

يمكن استخدام سلاسل من نبضات التيار بين أسلاك التسجيل لاستثارة السلوك بمجرد اكتمال التجربة بعد مرور خمس ثوانٍ من تيار مستمر بقوة 5 µA عبر أحد أطراف الأسلاك والقطب المرجعي لترسيب النحاس في الدماغ. ولتحديد موقع طرف السلك، تُعرض هنا آثار الجهد الخام من أقطاب كهربائية مفردة داخل حزمة tero واحدة. لاحظ الفرق في آثار الجهد بين الأقطاب الكهربائية المختلفة.

تم فرز ثلاث وحدات باستخدام وحدات التصنيف الدقيقة (MLUs). يُعرض هنا منظور ثلاثي الأبعاد لطاقة الموجة كما تم تسجيلها على ثلاثة من الأقطاب الكهربائية الأربعة. يمثل كل نقطة حدث عتبة واحدًا، مرمزًا لونيًا وفقًا للمجموعة التي تم تعيينه إليها في النهاية.

تم التقاط هذه اللقطة من فيديو لتجربة تسلق، حيث يظهر فوق كل إطار السرعة المُطبعة، وارتفاع الصرصور، ومعدل الومضات اللحظي لوحدتين مُفرزتين من الإطار الأول حتى الإطار الحالي. يشير الزمن صفر إلى بداية التسلق. تم تطبيع معدل الومضات من صفر إلى واحد، كما تم تطبيع السرعة والارتفاع من صفر إلى 0.5 لأغراض العرض. تشير العلامات الموجودة أسفل كل إطار إلى الومضات الخاصة بالوحدتين المُفرزتين خلال ثانية واحدة من الإطار الحالي. يشير الخط البرتقالي إلى الوقت الذي يغطيه كل إطار، بينما يشير المستطيل الأزرق إلى ضعف عرض النواة (kernel) التي استُخدمت لحساب معدل الومضات اللحظي للإطار الحالي.

تم إجراء هذا التسجيل في الجسم الذي يشبه المروحة في الجانب الأيمن. ارتفع معدل إطلاق الوحدة one one أثناء التسلق، وقد سبق الارتفاع في معدل الإطلاق الزيادة في السرعة. وكانت الوحدة one two صامتة قبل التسلق، ولكنها بدأت في الإطلاق بعد بدء عملية التسلق.

في هذه اللقطة من تجربة استكشاف الساحة، يشير الخط البيضاوي الأحمر إلى شكل الصرصور في هذا الإطار، بينما يشير الخط المقطع الأحمر إلى موقع مركز كتلة الصرصور في الإطارات العشرة السابقة. تظهر هنا سرعة الدوران والمشي إلى الأمام، بالإضافة إلى معدل الإطلاق اللحظي للوحدة 21. كما تظهر نبضات الوحدة 21 خلال أربع ثوانٍ من الإطار الحالي أسفل الإطار.

كما في السابق، يشير الخط البرتقالي إلى الوقت الذي يغطيه كل إطار، ويشير المستطيل الأزرق إلى ضعف عرض النواة (kernel) التي استُخدمت لحساب معدل الإطلاق اللحظي للإطار الحالي. تم إجراء هذا التسجيل في منتصف جسم المروحة. وقد استُخرج موقع الصرصور واتجاه جسمه في كل إطار باستخدام برنامج تتبع كما هو موضح في البروتوكول النصي، واستُخدمت هذه البيانات لحساب سرعة التقدم وسرعة التوجه بالإضافة إلى معدل الإطلاق اللحظي.

ارتفع معدل إطلاق وحدة 21 عندما بدأ الصرصور في المشي، وكان ذلك مرتبطاً بسرعة المشي. وبالنسبة للعديد من وحدات المجمع المركزي، اقتصر ارتفاع معدل الإطلاق على حالات حركية محددة. فعلى سبيل المثال، كانت الوحدة 21 مضبوطة على المشي للأمام بغض النظر عن سرعة الدوران.

يظهر هنا مسار الصرصور المأخوذ من الفيديو. تشير النقطة السوداء الكبيرة إلى نقطة بداية الصرصور، بينما تشير كل نقطة سوداء صغيرة إلى موقع الصرصور في كل إطار. تم ترميز المسار بالألوان لإظهار معدل إطلاق النبضات اللحظي للوحدة الثانية، حيث يتدرج اللون من الأزرق للإشارة إلى معدل إطلاق منخفض إلى الأحمر للإشارة إلى معدل إطلاق مرتفع.

في خريطة معدل إطلاق الخلايا هذه للوحدة two one، يمثل المحور X سرعة الدوران، ويمثل المحور Y سرعة المشي للأمام. تشير سرعة الدوران الموجبة إلى الدوران نحو اليمين، بينما تشير سرعة الدوران السالبة إلى الدوران نحو اليسار. يتم تحديد موقع القطب الكهربائي من خلال ترسبات النحاس المرئية بعد الإجراء النسيجي كما هو موضح في النص.

وبدلاً من ذلك، يمكن طلاء القطب بصبغة فلورية وتحديد موقعه باستخدام المجهر البؤري. وتُعد هذه مجموعة من التقنيات المعقدة التي تتطلب، حتى بعد إتقانها، وقتاً إجمالياً يصل إلى عدة ساعات؛ لذا يفضل تقسيم العناصر إلى مجموعات فرعية، وتصنيع واختبار العديد من الـ teros قبل البدء في تجربة الزرع.

من المهم تذكر إجراء اختبار مسبق للـ tero للتأكد من الممانعة السلكية البينية والفردية الصحيحة، وتوخي الحذر الشديد عند الزرع وتحديد عتبات التثبيت في الدماغ. ويمكن دمج طرق مثل التتبع الآلي في الوقت الفعلي لتبسيط إجراءات التحليل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وزرع الـ teros من أجل تنسيق النشاط الفسيولوجي مع السلوكيات المعقدة لحشرة تتحرك بحرية.