بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

الهدف العام من التجربة التالية هو استخلاص البروتين من أنسجة الدماغ البشرية ودماغ الفئران لإجراء تحليل البروتوميات. ويتم تحقيق ذلك باستخدام محلول تفكيك شائع للحصول على استخلاص بروتيني متماثل مكيّف لأساليب الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد. بعد ذلك، يُستخدم الفصل الكهربائي لهلام الفرق الفلوري ثنائي الأبعاد لفصل البروتينات من أجل تحديدها بواسطة مطياف الكتلة.

يتبع ذلك إجراء تحليل الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2D gel electrophoresis) مصغّر مع اللطخة المناعية (immuno blotting) لتحديد التعديلات ما بعد الترجمة. ويمكن أن تظهر النتائج تعبيراً بروتينياً شاملاً. وتوضح التغيرات الترجمية للمضيف جميع نواتج الربط والمنتجات التحفيزية بناءً على الاختلافات في نقطة التعادل الكهربائي والوزن الجزيئي.

يمكن أن يساعدنا الجمع بين تقنيتي 2D dash و 2D monolo في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال البروتيوميات العصبية من خلال توفير معلومات متزامنة حول تغيرات التعبير، والتعديلات ما بعد الترجمة، والتقويض في النواتج. ابدأ بجمع وتجانس أنسجة الدماغ. قم بتحضير الأنسجة بنسبة 10% وزن إلى حجم في محلول استخلاص مخصص لأنسجة الدماغ البشرية.

قم بتجانس الأنسجة باستخدام ماصة زجاجية، ومع ذلك، استخدم مجانس تيفلون لأنسجة القوارض لتفكيك أي من المتجانسات. قم بتسليط الموجات فوق الصوتية عليها بتردد 60 hertz باستخدام 30 نبضة مدة كل منها نصف ثانية. بعد ذلك، حدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد مع استخدام BSA كمعيار.

قم الآن بتجهيز المحاليل المستخدمة في الترسيب باستخدام الكلوروفورم والميثانول في دلو من الثلج. خطط لجمع حوالي 125 micrograms لشرائط IPG بطول 11 centimeter أو حوالي 1.25 milligrams لشرائط IPG بطول 18 centimeter. وبمجرد أن تصل درجة حرارة المحاليل إلى 4 °C، قم بإجراء عملية الترسيب بالكامل فوق الثلج.

أولاً، أضف ثلاثة أحجام من الميثانول، ثم حجماً واحداً من الكلوروفورم. رج هذا الخليط. بعد ذلك، أضف ثلاثة أحجام من الماء البارد.

قم برج mixture هذا المزيج باستخدام جهاز Vortex لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بطرد العينة مركزياً في أنبوب الطرد المركزي عند 12,000 Gs لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. اسحب السائل الطافي وتخلص منه. بعد ذلك، أضف ثلاثة أحجام من الميثانول، ثم استخدم جهاز Vortex وقم بعملية الطرد المركزي لترسيب البروتينات بنفس الطريقة.

جفف كتلة البروتين المجمعة تحت غاز النيتروجين قبل إجراء تقنية 2D DIGE. أعد تعليق البروتين في منظم 2D بتركيز 2.5 mg/mL. ثم قم بعملية السونيكة للعينات كما تم مسبقاً حتى يحين وقت استخدامها.

قم بتخزينها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية قبل البدء في هذه الخطوة وبعد ترسيب البروتين. ومن الضروري تحديد تركيز البروتين مرة أخرى باستخدام مقايسة Bradford، وذلك باتباع نفس الإجراء الموضح سابقاً قبل الوسم بصبغة psy.

يتم التحقق من جودة عينة البروتين بواسطة الفصل الكهربائي للهلام (SDS page) لهذا الغرض. قم بتخفيف 15 micrograms من البروتين في LDS وتسخينه إلى 37 °C في حمام مائي أو كتلة تسخين. ثم قم بإجراء الفصل الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد، واصبغ الهلام بمحلول كوماسي بلو لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد ذلك، يُترك الجل لليلة كاملة في محلول مكون من 7% acetic acid و 10% ethanol. وبمجرد التحقق من جودة عينة البروتين، يتم البدء في إجراء وسم SD في اليوم التالي. أولاً، يتم قياس pH المستخلص الخلوي (lysate)، والذي يجب أن يكون قاعدياً إلى متعادل.

درجة pH المثلى للتفاعلات اللاحقة هي 8.6. بعد ذلك، يتم إعداد تفاعلات اقتران الصبغة لكل عينة بروتينية. اخلط 50 micrograms مع 400 picomoles من صبغة S3، و 50 micrograms مع 400 picomoles من صبغة S خمسة.

قم بإجراء هذه العملية في أربع مكررات، ليكون المجموع ثماني تفاعلات اقتران D لكل عينة. وبالنسبة لكل عينة مختبرة، قم بإعداد مجموعة مكملة من تفاعلات اقتران DI باستخدام بروتين من عينة ضابطة، مثل دماغ مصاب بمرض ما. ثم لكل زوج من التفاعلات، قم بإعداد تفاعل ضابط داخلي يحتوي على 400 picomoles من CY two وتمثيل متكافئ لجميع البروتينات بإجمالي 250 micrograms.

يتم تحقيق وسم SAI من خلال تحضين جميع مخاليط التفاعل عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة. وبعد التحضين، تُجمع كل المجموعات المكونة من ثلاثة تفاعلات سيان مختلفة في أحجام قدرها 150 µL تضاف إلى كل مجموعة من التفاعلات التي تحتوي على 200 µL من Buffer 2D. ثم يتم المضي قدماً في خطوات الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد (2D electrophoresis).

ابدأ بتحضير محاليل بروتينية غير معلمة للهلام التحضيري الذي سيتم استئصال بقع البروتين منه لكل عينة وللعينة الضابطة الموجبة. قم بتقسيم 300 إلى 350 ميكروجرام من البروتين غير المعلم في محلول منظم ثنائي الأبعاد (2D buffer) واتركها لتعيد التميؤ أثناء تلامسها مع شريط IPG. بعد ذلك، قم بتحميل شرائط IPG ونقل البروتين المعلم وغير المعلم إلى عملية إعادة التميؤ.

بعد ذلك، قم بتغطية كل بئر بشريط تفاعل IPG. يتبع ذلك وضع طبقة من الزيت المعدني، وترك الشرائط لتعيد ترطيب نفسها سلبياً باستخدام محلول البروتين طوال الليل في درجة حرارة لا تتجاوز 25 degrees Celsius. وفي اليوم التالي، قم بإجراء التركيز المتساوي الكهربائي لشرائط IPG.

بعد ذلك، قم بإزالة الزيت وتخزين شرائح IPG عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لموازنة شرائح IPG. اغمرها في محلول موازنة لمدة 15 دقيقة. ثم انقل الشرائح إلى 4.7%IDO acetamide في محلول موازنة، خالي من DTT أثناء غمر الشرائح.

استخدم نظام هلام ثنائي الأبعاد (2D gel system) كبير لصب أربعة هلامات SDS page بتركيز 12% لكل عينة في ألواح زجاجية ذات فلورة منخفضة للبروتينات المسمىّة. صب أيضاً هلام SDS page واحد بتركيز 12% في ألواح زجاجية قياسية بسمك 1.5 مليمتر لكل من البروتينات غير المسمىّة. هذه هي الهلامات التحضيرية.

عندما تبرد الهلامات، انقل الشرائح إلى أعلى الهلامات وقم بتغطيتها بـ 0.5% Aros بمجرد أن تبرد، ثم قم بتشغيل الهلامات بقدرة 2.5 watts عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل وقم بتحليلها في اليوم التالي. يمكن إجراء العديد من تفاعلات 2D باستخدام عينات البروتين المستخدمة في الهلامات التحضيرية. قم بقياس أقل من 100 micrograms من العينة في 200 microliters من منظم 2D.

بعد ذلك، قم برج مزيج العينات بقوة باستخدام جهاز هزاز vortex ثم قم بتدويرها سريعاً في جهاز الطرد المركزي. حمّل العينات على شرائح IPG بطول 11 سنتيمتر واتركها تعيد الترطيب سلبياً طوال الليل وهي مغطاة بالزيت المعدني حتى اليوم التالي. ثم قم بإجراء التركيز المتساوي الكهربائية.

بعد ذلك، يتم نقل الشرائط عبر ثلاثة حمامات من محلول التوازن لمدة 15 دقيقة في كل حمام. ثم يتم تشغيل الشرائط على هلام SDS-PAGE ثنائي الأبعاد. ضع كل شريط فوق هلام مسبق الصب بالوزن الجزيئي المناسب.

استخدام البولي أكريلاميد لبروتين الدراسة. لاحقاً، يتم نقل الهلام إلى غشاء NITROCELLULOSE PVDF وتحليلها باستخدام الأجسام المضادة وفقاً لتطوير هذا البروتوكول. ثلاث طرق تحلل مختلفة.

تم اختبار المحاليل المنظمة. أولاً، تم اختبار محلول Tris SDS، وهو محلول منظم شائع الاستخدام في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.

أظهر محلول Tris SDS دقة فصل ضعيفة مقارنة بمحلول منظم آخر تم اختباره وهو UTS. كما تم استبعاد المحلول المنظم الثالث لعدم إمكانية تحضير العينات القابلة للاختبار باستخدامه. بعد ذلك، تم فحص البروتومات الخاصة بدماغ الإنسان والفأر.

تمت مقارنة عينات من قشرة الدماغ لدى البشر الأصحاء وعينات من القشرة الدماغية المصابة بمرض الزهايمر. كما تم فحص بروتينات دماغ الفئران التي تعاني من اعتلالات تاو الشبيهة بمرض الزهايمر بمقارنتها مع العينة البشرية. وتم فحص كل من SCI two بشكل مستقل، وكذلك S SI three وsci five لكل D. وقد سهّلت دقة تحديد البقع العالية عملية المحاذاة.

استُخدم تحليل ثنائي الأبعاد مصغر (mini 2D) نوعي لاستقصاء التعديلات ما بعد الترجمة، ووُجد أن بروتين alpha synuclein في النسيج الدهني يمتلك ملفاً طبيعياً، ولكنه وُجد أيضاً على شكل ثنائي القسيمة (dimer) مميز بعلامة النجمة. تشير الأسهم إلى المواضع التي وُجد فيها بروتين alpha synuclein. كما تم فحص بروتين سلف الأميلويد (amyloid precursor protein) الموّسم باليوبيكويتين بواسطة تحليل mini 2D.

تمت مقارنة مرض الزهايمر الفردي بمرض الزهايمر العائلي. وفي مرض الزهايمر العائلي، كانت تركيزات beta amyloid one to 42 و ISO variance أقل نظراً لوجود أشكال liga بوزن 8 kilodaltons. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية دراسة البروتوم من أجل مقارنة العينات المعقدة عن طريق قياس تعديلات التعبير البروتيني.