بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting
April 10th, 2014
بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.
الهدف العام من التجربة التالية هو استخراج البروتين من أنسجة دماغ الإنسان والفأر لتحليل البروتينات. يتم تحقيق ذلك باستخدام مخزن مؤقت للتحلل المشترك للحصول على نفس استخراج البروتين الذي تم تكييفه مع مناهج الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد. بعد ذلك ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد لفصل البروتينات لتحديد قياس الطيف الكتلي.
يتبع ذلك رحلان كهربائي هلام ثنائي الأبعاد مصغر مع نشاف مناعي لتحديد التعديلات اللاحقة للترجمة. يمكن أن تظهر النتائج تعبير البروتين العالمي. يغير المضيف الانتقالي جميع الأربطة والمنتجات التحفيزية بناء على الاختلافات في النقطة المتساوية والوزن الجزيئي.
يمكن أن يساعدنا الجمع بين اندفاعة ثنائية الأبعاد و monolo ثنائي الأبعاد في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال البروتينات العصبية من خلال توفير معلومات حول تغييرات التعبير في نفس الوقت. التعديل البريدي وتقويض المنتجات ابدأ بحصاد أنسجة المخ وتجانسها. تحضير الأنسجة بنسبة 10٪ من الوزن إلى الحجم في مخزن الاستخراج لأنسجة المخ البشري.
قمبتجانس الأنسجة باستخدام ماصة زجاجية ، ومع ذلك ، استخدم الخالط تفلون لأنسجة القوارض لتفكيك أي منهما متجانس. قم بصوتها عند 60 هرتز باستخدام 30 نبضة نصف ثانية. بعد ذلك ، حدد تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد باستخدام BSA كمعيار.
الآن اجمع محاليل ترسيب الميثانول الكلوروفورم في دلو ثلج. خطط لجمع حوالي 125 ميكروغراما لشرائط IPG مقاس 11 سم أو حوالي 1.25 ملليغرام لشرائط IPG مقاس 18 سم. بمجرد أن تصل المحاليل إلى أربع درجات مئوية ، قم بإجراء هطول الأمطار بالكامل على الجليد.
أولا ، أضف ثلاثة مجلدات من الميثانول ، ثم واحد من الكلوروفورم. رج هذا الخليط. بعد ذلك ، أضف ثلاثة أحجام من الماء البارد.
دوامة ، هذا الخليط لمدة دقيقة واحدة الطرد المركزي أنبوب العينة عند 12 ، 000 Gs لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استنشق وتخلص من المادة الطافية. ثم أضف ثلاثة أحجام من دوامة الميثانول وقم بتدوير البروتينات بنفس الطريقة.
جفف حبيبات البروتين المجمعة تحت غاز النيتروجين قبل 2D DIGE. أعد تعليق البروتين في المخزن المؤقت ثنائي الأبعاد عند 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر. ثم صوتنة العينات كما تم من قبل حتى يتم استخدامها.
قم بتخزينها على درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل البدء في هذه الخطوة وبعد ترسيب البروتين. من الضروري تحديد تركيز البروتين مرة أخرى عن طريق فحص برادفورد. باتباع نفس الإجراء كما هو موضح سابقا قبل وضع العلامات على الصبغة النفسية.
يتم التحقق من جودة عينة البروتين بواسطة صفحة SDS لهذا الغرض. تمييع 15 ميكروغرام من البروتين في LDS وهو إلى 37 درجة مئوية في حمام حراري أو كتلة. ثم قم بتشغيلها على جل بولي أكريلاميد ، وصمة عار الجل بمحلول كوماسي الأزرق لمدة ساعة على الأقل.
ثم احتجز الجل طوال الليل في 7٪ حمض الخليك ، 10٪ محلول الإيثانول. بمجرد تحديد جودة عينة البروتين ، في اليوم التالي يبدأ إجراء وضع العلامات على SD. قم أولا بقياس درجة الحموضة في المحللة ، والتي يجب أن تكون أساسية إلى محايدة.
الرقم الهيدروجيني الأمثل هو 8.6 للتفاعلات اللاحقة. بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعلات اقتران الصبغة لكل عينة بروتين. امزج 50 ميكروغراما مع 400 بيكومول من صبغة S3 و 50 ميكروغراما مع 400 بيكومول من صبغة S خمسة.
افعل ذلك في رباعي الإرسال ليصبح المجموع ثمانية تفاعلات اقتران D لكل عينة. لكل عينة تم اختبارها ، قم بعمل مجموعة مجانية من تفاعلات اقتران DI باستخدام البروتين من التحكم مثل الدماغ المريض. ثم لكل زوج من التفاعلات ، قم بإعداد تفاعل تحكم داخلي مع 400 بيكومول من CY اثنين وتمثيل متساو لجميع البروتينات التي يبلغ مجموعها 250 ميكروغراما.
يتم تحقيق وضع العلامات على SAI عن طريق احتضان جميع مخاليط التفاعل عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة ساعة. بعد الحضانة ، اجمع جميع مجموعات التفاعلات السماوية الثلاثة المختلفة في حجم 150 ميكرولتر لكل مجموعة من التفاعلات عند 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثنائي الأبعاد. ثم تابع خطوات الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد.
ابدأ بإعداد محاليل البروتين غير المسماة للهلام التحضيري الذي سيتم استئصال بقع البروتين منه لكل عينة وللتحكم الإيجابي. Aliquot 300 إلى 350 ميكروغرام من البروتين غير المسمى في مخزن مؤقت ثنائي الأبعاد والسماح لهم بإعادة الترطيب عند ملامستهم لشريط IPG. بعد ذلك ، قم بتحميل شرائط IPG لنقل البروتين المسمى وغير المسمى إلى إعادة الترطيب.
حسنا ، قم بتغطية كل بئر بشريط تفاعل IPG. اتبع ذلك مع تراكب من الزيت المعدني واسمح للشرائط بإعادة الترطيب بشكل سلبي بمحلول البروتين طوال الليل عند درجة حرارة لا تزيد عن 25 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإجراء تركيز متساوي الكهرباء لشرائط IPG.
ثم قم بإزالة الزيت وتخزين شرائح IPG عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لموازنة شرائط IPG. اغمرها في مخزن مؤقت للتوازن لمدة 15 دقيقة. ثم انقل الشرائط إلى 4.7٪ أسيتاميد IDO في مخزن مؤقت للتوازن ، ويفتقر إلى DTT أثناء الاستحمام الشريط.
استخدم نظاما هلاميا ثنائي الأبعاد كبيرا لصب أربعة مواد هلامية بنسبة 12٪ SDS لكل عينة في ألواح زجاجية منخفضة التألق للبروتينات المصنفة. صب أيضا هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ في ألواح زجاجية قياسية بسمك 1.5 ملم لكل بروتينات من البروتينات غير المسماة. هذه هي المواد الهلامية التحضيرية.
عندما يتم تبريد المواد الهلامية ، انقل الشرائط إلى الجزء العلوي من المواد الهلامية وقم بتراكب الشرائط بنسبة 0.5٪ Aros بمجرد تبريدها ، وقم بتشغيل المواد الهلامية عند 2.5 واط عند أربع درجات مئوية طوال الليل وقم بتحليلها في اليوم التالي. يمكن إجراء العديد من التفاعلات ثنائية الأبعاد باستخدام عينات البروتين المستخدمة في المواد الهلامية التحضيرية. قم بقياس أقل من 100 ميكروغرام من العينة إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثنائي الأبعاد.
ثم قم بتدوير مخاليط العينة بقوة وقم بدورانها بسرعة. قم بتحميل العينات على شرائط IPG مقاس 11 سم واتركها بإعادة الترطيب بشكل سلبي طوال الليل مغطاة بالزيت المعدني في اليوم التالي. أداء التركيز متساوي الكهرباء.
ثم حرك الشرائط من خلال ثلاثة حمامات من المخزن المؤقت للتوازن لمدة 15 دقيقة لكل حمام. ثم يتم تشغيل الشرائط على المواد الهلامية لصفحات 2D SDS. ضع كل شريط على هلام مسبق الصب بالوزن الجزيئي المناسب.
بولي أكريلاميد للبروتين محل الاهتمام. في وقت لاحق ، انقل المواد الهلامية إلى غشاء NITROCELLULOSE PVDF وقم بتحليلها بالأجسام المضادة في تطوير هذا البروتوكول. ثلاثة تحلل مختلف.
تم اختبار المخازن المؤقتة. أولا ، مخزن مؤقت مشترك للبيولوجيا الكيميائية الحيوية والجزيئية. تم اختبار Tris SDS.
كان لدى Tris SDS دقة ضعيفة مقارنة بمخزن مؤقت آخر تم اختباره UTS. تم استبعاد المخزن المؤقت الثالث ل de لأنه لا يمكن تحضير عينات قابلة للاختبار به. بعد ذلك ، تم التحقيق في بروتينات دماغ الإنسان والفأر.
تمت مقارنة عينات قشرة التحكم البشري وعينات القشرة الإعلانية. كما تم عرض بروتينات دماغ الفئران من الفئران المصابة بمرض الزهايمر مثل علم أمراض تاو من العينة البشرية. تم النظر إلى SCI two بشكل مستقل كما كان S SI ثلاثة و sci five لكل D. جعلت دقة البقعة العالية المحاذاة سهلة.
تم استخدام التحليل النوعي المصغر ثنائي الأبعاد للتحقيق في التعديلات اللاحقة للترجمة ووجد أن ألفا سينوكلين الرباط في الأنسجة الإعلانية له ملف تعريف طبيعي ، ولكن تم العثور عليه أيضا على أنه ثنائي يتميز بعلامة النجمة. تم وضع علامة على الأسهم حيث تم العثور على ألفا سينوكلين. كما تم عرض بروتين سلائف الأميلويد في كل مكان بواسطة Mini 2D.
تمت مقارنة الإعلان المتقطع بالإعلان العائلي. في العائلية ، يكون تباين الأميلويد من واحد إلى 42 وتباين ISO أقل تركيزا لأنه تم العثور على أشكال liga عند ثمانية كيلو دالتون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة البروتين من أجل مقارنة العينات المعقدة عن طريق قياس تعديلات تعبير البروتين.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تركز هذه الدراسة على استخراج البروتينات من أنسجة الدماغ البشري والفأري باستخدام عازل انحلالي شائع لتحليل البروتينات. تسمح الطريقة بتحديد وتوصيف البروتينات من خلال تقنيات كهربائية صاعية متطورة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- تحليل البروتينات
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- استخراج البروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم وظائف الدماغ.
- تقنيات الكهربائية الصاعية ثنائية الأبعاد تعزز فصل البروتينات.
- التعديلات بعد الترجمة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على وظيفة البروتين.
- هناك حاجة إلى طرق موثوقة لنتائج قابلة للتكرار في خزعات الأنسجة والنماذج.
غرض الدراسة
- استخراج البروتينات من أنسجة الدماغ للتحليل.
- استخدام كهربائية صاعية ثنائية الأبعاد للفرق في اللمعان الفلوري.
- تحديد التعديلات بعد الترجمة من خلال الغربلة المناعية.
الطرق المستخدمة
- استخراج البروتينات باستخدام عازل اليوريا/ثيوريا/SDS.
- كهربائية صاعية ثنائية الأبعاد للفرق في اللمعان الفلوري (2D-DIGE).
- كهربائية صاعية ثنائية الأبعاد صغيرة للغربلة المناعية.
- التحليل الطيفي الكتلي لتحديد البروتينات.
النتائج الرئيسية
- استخراج ناجح للبروتينات من أنسجة الدماغ البشرية والفأرية.
- تحديد البروتينات باستخدام التحليل الطيفي الكتلي.
- توصيف التعديلات بعد الترجمة.
- زيادة قابلية تكرار النتائج من خزعات الأنسجة والنماذج.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة نتائج موثوقة لتحليل البروتينات.
- تسهل دراسة التعبير عن البروتينات والتعديلات.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الدراسات العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
