اللجنين أسفل تنظيم ذرة شامية عبر dsRNAi وKlason تحليل اللجنين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليل تنظيم محتوى اللجنين في المتاهة عبر RNAi لتسهيل إنتاج الكتلة الحيوية القابلة للهضم لإنتاج الإيثانول الحيوي وقياس محتوى اللجنين باستخدام بروتوكول قياس اللجنين كلايسون. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء متاهة CCR واحدة بلازميد RNAi أولا لتقليل تنظيم زيت التخليق الحيوي المرتبط باللجنين COA Reducta. بعد ذلك ، يتم تحويل كالي الذرة المرتفعة مع بناء RNAi واحد ZM CCR باستخدام قصف الجسيمات ويتم إنشاء خطوط معدلة وراثيا متماثلة اللواقح.

ثم يتم ملاحظة التغيرات المظهرية عن طريق الفحص النسيجي وعن طريق مسح المجهر الإلكتروني الذي يتم إجراؤه على الأجيال الأولى والثانية والثالثة من المتاهة المعدلة وراثيا. أخيرا ، يتم قياس اللجنين غير القابل للذوبان في الحمض أو الكلاسون من خطوط المتاهة المعدلة وراثيا ومقارنتها بمحتوى اللجنين في نباتات المتاهة غير المعدلة وراثيا. في النهاية ، تم الحصول على النتائج التي تظهر انخفاضا بنسبة 10٪ من اللجنين في نباتات المتاهة المعدلة وراثيا CCR مقارنة بالنباتات البرية باستخدام قصف الجسيمات وكما هو محدد من خلال قياس اللجنين كلايسون ، يعد العرض المرئي النهائي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن بعض الخطوات يصعب تعلمها وتشمل هذه الخطوات التي يصعب تعلمها تحضير ذرة Embry ، كالي تحت حالة معقمة طلاء الخزانات على الجسيمات مع الحمض النووي البلازميد وقصف الجسيمات من كالي ، الدكتور حسين علاء الدين ، والدكتور جلي برو هان والجامعي.

سيظهر دونالد هذا البحث من خلال إظهار الإجراءات من خلال قصف الجسيمات. تتمثل الآثار المترتبة على تقنية قياس اللجنين كلايسون لإنتاج الإيثانول الحيوي في أنها لا توفر فقط معلومات تتعلق بكميات لجنين كلايسون في مواد ليجنانو سيلوز مختلفة ، ولكنها توفر أيضا نظرة ثاقبة حول مدى مقاومة الكتلة الحيوية للسيلوز اللاني لإنزيمات السيلوليت أثناء المعالجة المسبقة. لتحضير جزيئات التنغستن ، ابدأ بوضع 60 ملليغرام من حبات التنغستن في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

اغسلها بإضافة مليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول والدوامة لمدة دقيقتين. ثم تحتضن عند 23 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وجهاز الطرد المركزي عند 18،894 مرة G لمدة دقيقتين قبل التخلص من المادة الطافية. استخدم ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ لغسل الخرز ثلاث مرات.

ثم أضف ملليلترا واحدا من الجلسرين المعقم بنسبة 50٪ ليصل تركيز الجسيمات الدقيقة إلى 60 ملليغرام لكل ملليلتر. لتحضير الحمض النووي للقصف ، ضع 50 ميكرولترا من حبات التنغستن في الجلسرين في أنبوب سعة 1.5 مليلتر وأضف الدوامة التالية بين كل إصدار. ميكروغرام واحد من IV 1.1 ZM CCR واحد RNAi البلازميد DNA ، أعدت وفقا لبروتوكول النص.

50 ميكرولتر من 2.5 كلوريد الكالسيوم المولاري ، و 20 ميكرولتر من 0.1 منوي مولاري. بعد دوامة نهائية ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 18 ، 894 مرة G لمدة 30 ثانية. ثم اسكب المادة الطافية واستخدم 140 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ لغسل الحبيبات مرتين بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضف 48 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الخرزات واستخدمها على الفور أو خزنها على الجليد لمدة تصل إلى أربع ساعات قبل القصف قبل أربع ساعات على الأقل من القصف.

ضع كالي بارتفاع ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات ، متاهة جنينية في منتصف طبق بتري 100 ملم يحتوي على وسط N six OSM. قم بإعداد جهاز توصيل جزيئات الهيليوم PSD 1000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدم 70٪ من الإيثانول لتعقيم جدار الغرفة. بعد ذلك ، قم بتحميل قرص تمزق معقم 650 رطل لكل بوصة مربعة في غطاء التثبيت المعقم.

ثم انشر خمسة إلى ستة ميكرولترات من محلول الحمض النووي M 10 على سطح حامل كبير وجففه لفترة وجيزة. قبل تحميل الناقل الكلي وشاشة التوقف في مجموعة إطلاق الناقل الصغير ، ضع مجموعة إطلاق الناقل الصغير وكالي المتاهة في الغرفة على مسافة محددة من شاشة التوقف وأغلق الباب. تسارع في فراغ 27 رطل لكل بوصة مربعة مقابل شاشة الشبكة السلكية.

اضغط على زر النار حتى ينفجر قرص التمزق وينخفض ضغط الهيليوم إلى الصفر على المقياس. ثم حرر زر النار. انقل الكالي المقصف إلى طبق بتري يحتوي على N six OSM واحتضانه لمدة 16 ساعة في الظلام عند 27 درجة مئوية.

ثم قسم الكالي إلى حوالي 10 قطع وانقلها إلى N six E أو وسط الحث القاسي في أطباق بتري واحتضانها لمدة خمسة أيام في الظلام عند 27 درجة مئوية. بعد حوالي ثمانية إلى 10 أسابيع ، ستنمو القطاعات البيضاء سريعة النمو من القطاعات غير المتكاثرة والمنخرية جزئيا. تقوم العين الأم C باستئصال الأنسجة البيضاء سريعة النمو ونقلها إلى وسط اختيار جديد ، والاستمرار في احتضانها ، ونقل الكالي الجنيني الأبيض وسريع النمو إلى وسط التجديد واحتضانه في الظلام عند 27 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد قبل التحول إلى فترة 16 ساعة من ضوء النهار وثماني ساعات مظلمة عند 25 إلى 27 درجة مئوية.

بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع ، انقل البراعم المتجددة إلى وسط التجذير في أنبوب خيمة زجاجي واستمر في الحضانة في دورة مظلمة فاتحة بعد ظهور نمو جذر كبير ، استخدم ماء الصنبور لغسل الجذور بعناية. ثم قم بزرع النبتات في أواني بحجم أربعة بوصات بالتربة. غطي الأواني بأكياس بلاستيكية للحفاظ على رطوبة النباتات.

بعد يومين ، قم بعمل ثقوب صغيرة في الأكياس البلاستيكية. ثم بعد خمسة إلى ستة أيام ، قم بإزالة الأكياس البلاستيكية. استمر في الحضانة لمدة خمسة إلى ستة أيام أخرى.

انقل الشتلات إلى أواني مقاس 18 بوصة بها تربة وحافظ عليها في ضوء الشمس الصيفي الكامل أو ضوء الدفيئة. تسمى النباتات الأولية المتجددة T صفر بينما تنتمي البذور الأولى إلى الجيل T واحد. لأخذ قياسات لجنين كلايسون ، قم بطحن العينات من خلال شاشة بحجم ملليمترين.

ثم استخدم محلل الرطوبة لتحديد محتوى الرطوبة لكل عينة وتسجيل القيمة. قم بوزن حوالي 1.5 جرام من كل عينة وسجل الوزن باستخدام مستخرج مذيب آلي. استخدم الماء لاستخراج العينات.

ثم استخدم الإيثانول لاستخراجها مرة ثانية. جفف العينات المستخرجة عند 45 درجة مئوية طوال الليل. ثم اتركها تبرد في المجفف قبل وزنها مرة أخرى.

بعد ذلك ، قم بقياس 0.3 جرام من كل عينة مستخرجة جافة في ثلاثة أنابيب ضغط عال علوية لولبية ، وسجل الأوزان لأقرب 10 من المليغرام. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من 72٪ من حمض الكبريتيك إلى كل أنبوب ضغط. استخدم قضبان التحريك الزجاجية أو التفلون لخلط العينات وترك قضبان التحريك في الأنابيب.

احتضان القوارير عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عند 150 دورة في الدقيقة. ثم أضف 84 مل من الماء منزوع الأيونات لتخفيف تركيز الحمض إلى 4٪ ، وخلطها مع قضيب التقليب. احرص على عدم ترك كميات كبيرة من العينة على جانبي القارورة فوق خط الماء.

بعد إغلاق السدادات بإحكام على جميع القوارير ، ضعها في رف معدني أو أكواب كبيرة وقم بتعقيمها عند 121 درجة مئوية. باستخدام دورة تعقيم سائل لمدة ساعة واحدة ، اتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفتح. قم بتقطيع بوتقات الترشيح مسبقا في فرن عند 575 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل.

ثم اترك البوتقات تبرد في الجفاف لمدة ساعة واحدة على الأقل باستخدام محول مطاطي لتأمين كل فراغ بوتقة ، وقم بتصفية المحلول من كل أنبوب من خلال بوتقة منفصلة. استخدم الماء منزوع الأيونات لشطف الجزيئات من كل أنبوب. جفف بقايا اللجنين عند 105 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل قبل تسجيل وزن البوتقة الجافة والبقايا.

باستخدام فرن 575 درجة مئوية. قم بإطلاق العينات مسبقا فوق موقد بنسن حتى لا يكون هناك دخان أو رماد مرئي قبل وضعها في الفرن لمدة 24 ساعة. أخرج البوتقات من الفرن واتركها تبرد في المجفف.

أخيرا ، احسب بقايا الحمض غير القابلة للذوبان باستخدام المعادلة التالية حيث M pre يساوي كتلة الكتلة الحيوية المستخرجة قبل ex ، M post يساوي كتلة الكتلة الحيوية المستخرجة من postex. قارورة M تساوي كتلة الكتلة الحيوية المستخرجة المضافة إلى بقايا M القارورة تساوي كتلة البوتقة وبقايا اللجنين. رماد M يساوي كتلة البوتقة والرماد و mc يساوي محتوى الرطوبة في الكتلة الحيوية المستخرجة قبل السابق.

أدى انخفاض أساس الوزن الإجمالي في محتوى اللجنين في المتاهة عبر تحويل قصف جسيمات DS RNAi إلى ما يقرب من 30٪ من إسكات الجينات ل zm CCR واحد لوحظ باستمرار في T صفر إلى T جيلين مقارنة بنباتات التحكم. نمت الجينات المعدلة وراثيا بالمثل باستثناء اللون البني في الورقة وقشر الضلع الأوسط والساق كما هو موضح هنا. كشف التحليل النسيجي أن الخطوط الطافرة تظهر انخفاضا كبيرا في سمك جدار الخلية لألياف الإينما.

ومع ذلك ، بدا تدفق وعاء نسيج الخشب وخلايا الغمد مشابهة للنباتات البرية ، مما يشير إلى عدم وجود آثار ضارة على نقل المياه أو نقل المغذيات أو القوة الميكانيكية للسيقان في الخطوط الطافرة. يوضح هذا الشكل كمية اللجنين غير القابل للذوبان في الحمض في متاهة النوع البري و zm CCR واحد خطوط RNAi المعدلة وراثيا. أظهرت ثلاثة خطوط معدلة وراثيا انخفاضا معتدا به إحصائيا في اللجنين مقارنة بالنباتات البرية لتحديد ما إذا كان تدفق الكربون قد تحول من مسار التخليق الحيوي للجنين إلى مسارات التخليق الحيوي للكربوهيدرات لجدار الخلية.

تم تحليل السليلوز عبر طريقة الرسم البياني كما هو موضح في هذه المخطط. احتوى خطان متحولان من zm CCR واحد RNAi على مستويات متزايدة بشكل كبير من السليلوز البلوري. ومع ذلك ، كشف تحليل محتوى السليلوز الهيمي عن عدم وجود تغييرات في الخطوط الطافرة بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصور البصري المعدل وراثيا للنباتات. ستوفر هذه التقنية إرشادات للباحثين الذين يحتاجون إلى إدخال جين ذي أهمية في ترددات التحويل العالية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تطبيق تقنية قصف الجسيمات التي نستخدمها لنقل الجينات إلى أحاديات الفلقة الأخرى مثل القمح والأرز والذرة الرفيعة وغيرها من النباتات الثنائية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس لجنين كلايسون من لي ، بدون مواد حيوية للسليلوز. من المهم الإشارة إلى أن العمل مع 72٪ من حامض الكبريتيك يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذلك يجب على أي موظف يتعامل مع المادة الكيميائية توخي الحذر الشديد والحفاظ على المواد الكيميائية وخزانات السلامة والعمل معها فقط تحت غطاء الدخان.