الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج

الهدف العام من الإجراء التالي هو تقييم القدرة الغازية للخلايا السرطانية باستخدام مقايسة غزو ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا السرطانية أولا في مصفوفة غشاء القاعد. ثم يتم ملاحظة الغزو الخلوي للمصفوفة لمدة خمسة أيام أو أكثر عبر الفحص المجهري الضوئي.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تصنيف الخلايا بأجسام مضادة فلورية لتوطين البروتينات ذات الأهمية. في النهاية ، يمكن تحليل معدل غزو الخلايا السرطانية والتغيرات الناتجة في تعبير البروتين عن طريق الفحص المجهري المناعي الفلوري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل مقايسة غزو غرفة Transwell ، هي أن مقايسة غزو الهلام الرئيسية ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أفضل البيئة في الجسم الحي التي يحلها السرطان في النمو.

المترتبة على هذه التقنية هي علاج السرطان ، حيث يمكن تحديد بروتينات جديدة في الدراسة ، والتي تشارك في غزو السرطان ورم خبيث. قبل البدء في إجراء الاستزراع ، ضع مصفوفة الغشاء القاعدي ، ماصة P 200 وأطراف الماصة على الجليد طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، استخدم طرف الماصة المثلجة 200 ميكرولتر لنشر 50 ميكرولترا من المصفوفة في نمط حلزوني على الجزء السفلي من الطبق السفلي الزجاجي متحد البؤر.

ثم ضع الطبق في حاضنة لزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة على الأقل أثناء خضوع المصفوفة لعيون التربسين التصلب ، وهي صفيحة من الخلايا بنسبة 70 إلى 80٪ من الخلايا الملتقى 100 ملم بمجرد أن تبدأ الخلايا في الانفصال. قم بتعطيل التربسين ب 10 ملليلتر من الوسط ، ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 100 جي وأربع درجات مئوية أثناء دوران الخلايا.

50 ميكرولترا من المصفوفة في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد مليلتر واحد لكل طبق من مصفوفة الغشاء القاعدي ، وضع الأنابيب على الجليد عندما تنتهي الخلايا من الدوران. استنشق المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، ثم إعادة الضغط. قم بتعليق الخلايا في مليلتر واحد من الوسائط وعدها بعد ذلك.

انقل 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يعلو تعليق الخلية بالوسائط إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا. ثم أضف 50 ميكرولترا من مصفوفة الغشاء القاعدي المثلج البارد إلى الخلايا بنسبة واحد إلى واحد للحصول على حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. قم بوضع المصفوفة برفق إلى خليط الخلية على مصفوفة الغشاء القاعدي المتصلبة ، واسمح للخلايا بالاندماج في المصفوفة في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد 30 دقيقة ، قم بتغطية المصفوفة بملليلترين من الوسائط وأعد الطبق إلى الحاضنة ، وقم بتغيير الوسائط كل يوم طوال مدة التجربة ، واستخدم هدف 10 × من المجهر الضوئي مرة واحدة كل يوم طوال مدة التجربة لأخذ 20 تداخلا تفاضليا. صور متباينة للمستعمرات المعلقة في مصفوفة الغشاء القاعدي. قم بتحليل الصور بشكل أعمى لتحديد تكوين نجمة مستعمرة الخلية.

تعتبر مستعمرة أن تكون نجمية إذا لوحظت إسقاطات واحدة أو أكثر من الستيرويد من الخلايا. لفحص السمات المورفولوجية للمستعمرات ثلاثية الأبعاد ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وضعها على صينية من الثلج. استنشق الوسائط ثم اغسل المستعمرة ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من PBS البارد.

بعد الغسيل الأخير ، قم بإصلاح الخلايا في ملليلترين من 20٪ أسيتون ، 80٪ محلول ميثانول لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم أعد الأطباق إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تكون مصفوفة الغشاء القاعدي في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط المثبت واغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام PBS كما هو موضح للتو. بعد الغسيل النهائي ، قم بحظر أي ارتباط غير محدد على الخلايا بملليلترين من 3٪ BSA لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

ثم احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية المخففة في 3٪ BSA في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي بعد غسل الجسم المضاد الأولي غير المرتبط ثلاث مرات باستخدام PBS ، وأضف الجسم المضاد الثانوي المذاب في 3٪ BSA عند التخفيف المناسب واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد غسل الجسم المضاد الثانوي غير المرتبط ب PBS ، قم بتلطيخ نوى الخلايا في ملليلترين من hext 3 ، 3 ، 2 ، 5 8 في PBS لمدة خمس دقائق في الظلام.

ثم اغسل السداسي غير المرتبط من الخلايا خمس مرات باستخدام PBS. بعد الغسيل الخامس ، أضف وسيط التثبيت مباشرة على المصفوفة إلى خليط الخلية وقم بتغطية وسط التثبيت بعناية بزلة غطاء زجاجي لمنع أي اضطرابات في سلامة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى خليط الخلية. جفف الطبق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، ثم احصل على صور بمجهر فلوري بأطوال موجات الليزر المناسبة للأجسام المضادة المستخدمة في هذه الصور.

MDA MB 2 3 1 يتم توضيح الخلايا التي تغزو مصفوفة ثلاثية الأبعاد. تم دمج الخلايا في المصفوفة في اليوم الأول وبدأت في تكوين هياكل نجمية غازية بحلول اليوم الثالث. بحلول اليوم الخامس ، يمكن ملاحظة غزو كامل للمصفوفة.

ثم تم حساب عدد المستعمرات النجمية المتكونة والتعبير عنها كنسبة مئوية من العدد الإجمالي للمستعمرات الغازية وغير الغازية لكل طبق. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن القياسات كانت تكتمل يوميا لمدة خمسة أيام ، يمكن أيضا تقييم معدل الغزو في هذه الصور المناعية الفلورية. تظهر المستعمرات النجمية الغازية التمثيلية لخلايا MDA MB 2 3 1 التي تظهر فقدانا لسلامة الغشاء وتوطين منتشر لبروتين الغشاء القاعدي اللامينين خمسة في تناقض صارخ مع ما لوحظ في خلايا سرطان الثدي MDA MB 2 31.

تم توطين اللامينين الخمسة في طبقة غشاء القاعدية السليمة التي تحيط بذاكرة أسينين خلايا MCF 10 A غير المعالجة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء الزراعة المشتركة مع الخلايا اللحمية للإجابة على أسئلة إضافية مثل هل تتشابك الخلايا السرطانية مع الخلايا اللحمية في البيئة المكروية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأورام لاستكشاف غزو السرطان وهجرته ، وكلاهما ضروري للانتشار النقيلي للخلايا السرطانية.