الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج

الهدف العام من الإجراء التالي هو تقييم القدرة الغزوية للخلايا السرطانية باستخدام مقايسة غزو ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة الخلايا السرطانية في مصفوفة الغشاء القاعدي، ثم يتم رصد الغزو الخلوي للمصفوفة لمدة خمسة أيام أو أكثر عبر المجهر الضوئي.

في الخطوة النهائية، يتم وسم الخلايا بأجسام مضادة فلورية لتحديد مواقع البروتينات المستهدفة. وفي النهاية، يمكن تحليل معدل غزو الخلايا السرطانية والتغيرات الناتجة في التعبير البروتيني باستخدام المجهر المناعي الفلوري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الموجودة، مثل مقايسة غزو غرفة Transwell، في أن مقايسة غزو الهلام ثلاثي الأبعاد تحاكي بشكل أفضل البيئة الحيوية التي تنمو فيها الخلايا السرطانية.

تكمن أهمية هذه التقنية في علاج السرطان، حيث يمكن تحديد بروتينات جديدة في الدراسة تساهم في غزو السرطان وانتشاره. قبل البدء في إجراءات الزرع، ضع مصفوفة الغشاء القاعدي وماصة P 200 ورؤوس الماصات على الثلج طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، استخدم رأس الماصة البالغ سعتها 200 µL والمبردة بالثلج لتوزيع 50 µL من المصفوفة بنمط حلزوني على قاع طبق زجاجي مخصص للمجهر البؤري من النوع رقم واحد.

بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 °C مع 5% carbon dioxide لمدة 30 دقيقة على الأقل بينما تخضع المصفوفة للتصلب. أضف التربسين إلى طبق خلايا بقطر 100 مليمتر بنسبة تلاقي 70 إلى 80% بمجرد أن تبدأ الخلايا في الانفصال. قم بإبطال مفعول التربسين باستخدام 10 milliliters من الوسط الغذائي، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 100 Gs و4 °C بينما تترسب الخلايا في القاع.

قم بتوزيع 50 µL من المصفوفة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1 mL لكل طبق من مصفوفة الغشاء القاعدي، وضع الأنابيب على الثلج عند انتهاء عملية تدوير الخلايا. اسحب السائل الطافي دون تحريك الراسب، ثم قم بإعادة تعليق الخلايا في 1 mL من الوسط الغذائي وعدّها بعد ذلك.

انقل 2.5 × 10⁴ من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد، وأكمل حجم معلق الخلايا باستخدام الوسط الغذائي ليصل إلى حجم نهائي قدره 50 µL. بعد ذلك، أضف 50 µL من مصفوفة الغشاء القاعدي المبردة إلى الخلايا بنسبة واحد إلى واحد، ليصبح الحجم النهائي 100 µL. وزع خليط المصفوفة والخلايا برفق فوق مصفوفة الغشاء القاعدي المتصلبة، واترك الخلايا لتندمج داخل المصفوفة في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد مرور 30 دقيقة، غطِّ المصفوفة بملليلترين من الوسط الغذائي وأعد الطبق إلى الحاضنة، مع تغيير الوسط الغذائي يومياً طوال مدة التجربة، واستخدم العدسة الشيئية 10x للمجهر الضوئي مرة واحدة يومياً طوال مدة التجربة لالتقاط 20 صورة تباين تداخلي تفاضلي للمستعمرات المعلقة في مصفوفة الغشاء القاعدي. قم بتحليل الصور بشكل أعمى لتحديد التشكيل النجمي لمستعمرات الخلايا.

تُعتبر المستعمرة نجمية الشكل إذا لوحظ وجود نتوء واحد أو أكثر من مجموعة الخلايا. لفحص الخصائص المورفوجينية للمستعمرات ثلاثية الأبعاد، قم بإخراج الخلايا من الحاضنة ووضعها على صينية ثلج. قم بشفط الوسط ثم اغسل المستعمرة ثلاث مرات باستخدام 2 mL من PBS البارد.

بعد الغسلة الأخيرة، قم بتثبيت الخلايا في مليليترين من محلول مكون من 20%acetone و80%methanol لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم أعد الأطباق إلى درجة حرارة الغرفة. وبمجرد وصول مصفوفة الغشاء القاعدي إلى درجة حرارة الغرفة، اسحب المثبت واغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام PBS كما تم توضيحه للتو. وبعد الغسلة النهائية، قم بحجب أي ارتباط غير محدد على الخلايا باستخدام مليليترين من 3%BSA لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، تُحضن الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المطلوبة والمخففة في 3%BSA في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور ساعة، يتم إزالة محلول الأجسام المضادة الأولية بعد غسل الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم يُضاف الجسم المضاد الثانوي المذاب في 3%BSA بالتخفيف المناسب، وتُحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. وبعد غسل الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة باستخدام PBS، تُصبغ نوى الخلايا في ملي لترين من hext 3, 3, 2, 5 8 في PBS لمدة خمس دقائق في الظلام.

بعد ذلك، اغسل الخلايا خمس مرات باستخدام PBS لإزالة الـ hext غير المرتبط. وبعد الغسلة الخامسة، أضف وسط التثبيت مباشرة فوق خليط المصفوفة والخلايا، ثم غطِّ وسط التثبيت بعناية باستخدام شريحة زجاجية غطائية لمنع حدوث أي خلل في سلامة خليط المصفوفة الغشائية القاعدية والخلايا. اترك الطبق ليجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة، ثم التقط الصور باستخدام مجهر فلوري عند أطوال موجات الليزر المناسبة للأجسام المضادة المستخدمة في هذه الصور.

توضح الصور خلايا MDA MB 2 3 1 وهي تغزو مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D matrix). حيث تم دمج الخلايا في المصفوفة في اليوم الأول وبدأت في تكوين تراكيب نجمية غازية بحلول اليوم الثالث. وبحلول اليوم الخامس، يمكن ملاحظة غزو كامل للمصفوفة.

تم بعد ذلك عد عدد المستعمرات النجمية التي تشكلت والتعبير عنها كنسبة مئوية من العدد الإجمالي للمستعمرات الغازية وغير الغازية في كل طبق. بالإضافة إلى ذلك، وبما أن القياسات قد اكتملت يومياً لمدة خمسة أيام، أمكن أيضاً تقييم معدل الغزو في هذه الصور المناعية الفلورية. وتظهر مستعمرات نجمية غازية ممثلة لخلايا MDA MB 2 3 1 فقدان سلامة الغشاء وتوطناً منتشراً لبروتين الغشاء القاعدي laminin five، وهو ما يظهر في تباين صارخ مع ما لوحظ في خلايا سرطان الثدي MDA MB 2 31.

تم تحديد موقع اللامينين 5 في طبقة غشاء قاعدي سليمة تحيط بالخلايا غير الخبيثة غير المعالجة من نوع MCF 10 A. عقب هذا الإجراء، يمكن إجراء زراعة مشتركة مع الخلايا السدوية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كانت الخلايا السرطانية تتواصل مع الخلايا السدوية في البيئة الدقيقة بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأورام لاستكشاف غزو السرطان وهجرته، وكلاهما ضروري للانتشار النقائلي للخلايا السرطانية.