على الفحص لتجديد الخط الجانبي في اسماك الزرد الكبار

لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة بدلا من الجنين / اليرقات، وضعنا كمية الجانبي الخط التجديدي الفحص التي يمكن تطبيقها على نماذج المرض الزرد الكبار. تشارك مقايسة القرار في 1) neuromast و2) مستويات خلية الشعر الفردية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير مقايسة تجديد الخط الجانبي الكمي التي يمكن تطبيقها على نموذج مرض الزرد البالغ. يتم تحقيق ذلك عن طريق استئصال الخط الجانبي لأسماك الحمار الوحشي البالغة أولا عن طريق معالجتها لمدة 24 ساعة بالجنتامايسين. بعد ذلك ، يتم غسل الجنتاميسين ويسمح للأسماك بتجديد الصواري العصبية لأوقات مختلفة في المياه العذبة.

ثم يتم تلطيخ الأسماك بصبغة حيوية لتصور الانتعاش الجانبي في نقاط زمنية محددة. للتأكد من أن الدواء كان فعالا في استئصال الصواري العصبية ، يجب تلطيخ بعض الأسماك مباشرة بعد غسل الجنتامايسين. ثم يتم حساب الصواري العصبية للخطوط الجانبية على الأسماك أو مستحضرات الجلد باستخدام الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر فلوري أو متحد البؤر.

أخيرا ، تتم مقارنة المجموعات التجريبية كميا بالمجموعة الضابطة باستخدام منحنى قياسي للصاري العصبي المتجدد. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري ومتحد البؤر لمراقبة تجديد الخط الجانبي في نماذج مرض الزرد البالغة. قمنا بتطوير هذه التقنية لتوفير اختبار كمي لفحص تجديد الخلايا العصبية في نماذج مرض الزرد البالغة للحث على نخر خلايا الشعر ، ابدأ بإضافة محلول 50 ملليغرام لكل مليلتر من كبريتات الجنتاميسين في ماء السمك إلى تركيز نهائي قدره 0.004٪ باستخدام وعاء كبير بما يكفي لإيواء أسماك الحمار الوحشي التي يبلغ عمرها أربعة إلى ستة أشهر بدون تهوية ، املأه بمحلول جنتامايسين.

ضع السمك بالداخل واحتضنه على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بإعداد حوض أسماك من مياه السمك العادية لغسل الجنتامايسين. بعد غسل الجنتاميسين ، ضع السمك في ماء السمك العادي وأعده إلى حاضنة 28 درجة مئوية لمدة ثماني إلى 16 ساعة من محلول مخزون عمل 15 ملليغرام لكل مليلتر من الصبغة الحيوية الفلورية.

أربعة أربعة داثيل أمينو ستايرو وميثيل بيريديوم يوديد أو أربعة صبغة اثنان أ. تحضير تركيز 0.08٪ في ماء السمك بعد وقت التعافي المحدد من معالجة الجنتاميسين ، ضع كل سمكة في بئر صفيحة استزراع ستة آبار تحتوي على الصبغة الحيوية. قم بتغطية الألواح وضعها في درج مقاعد البدلاء بواسطة المجهر الفلوري لفحص الصواري العصبية الملطخة. أطفئ الأنوار لمنع إخماد الصبغة الحيوية واحتضانها لمدة ساعة واحدة في الساعة المحددة ، بعد غسل الجنتاميسين.

قم بتخدير كل سمكة عن طريق وضعها في ماء مخدر وانتظر حتى تتوقف حركة السباحة لمدة دقيقة إلى دقيقتين تقريبا. بعد ذلك ، امسح كل سمكة على منشفة ورقية وضعها على قطعة من ورق الترشيح المبلل تتمركز حول غطاء طبق بتري بلاستيكي. ثم ضع الغطاء على مسرح مجهر ستيريو فلوري واستخدم تكبيرين x لالتقاط الصور للتحليل الكمي لتحديد مقدار التجديد ، احسب عدد الأقنعة العصبية المرئية داخل الغرز الأربع المحددة على الجانب السفلي البطني من السمكة بالقرب من الزعنفة الصدرية اليمنى.

استخدم اختبار T الخاص بالطالب أو ANOVA للتحليل الإحصائي وكرر جميع التجارب ثلاث مرات بحد أدنى خمس أسماك لكل تجربة. إذا لم يكن التحليل الكمي على مستوى الصاري العصبي مهما ، فيمكن أيضا استخدام التحليل على مستوى خلية الشعر الفردية للحصول على درجة أعلى من الدقة. بعد تلطيخ الأسماك وغسلها ، استخدم تخفيفا من واحد إلى 500 من اثنين من الفينوكسي إيثانول للقتل الرحيم تحت الضوء الخافت.

قم بعمل شق عبر البطن وقم بعمل شقين رأسيين على كل جانب من أول شقين. ثم اصنع رفرف جلدي مربع عن طريق عمل شق على طول الأضلاع العلوية للأسماكة حتى يتماشى مع زعانف الشرج. ضع عينة الجلد على شريحة زجاجية ، ضع الأروس في الأعلى ، ثم ضع غطاء زجاجي دائري فوقها للمساعدة في تثبيت الأنسجة وتسطيحها.

للتصوير الرقمي اللاحق. استخدم هدفا 60 × لالتقاط صور رقمية لخلايا الشعر داخل كل صاري عصبي لغرز منتصف الجسم. ثم عد خلايا الشعر داخل الأقنعة العصبية الفردية للتحليل المقارن والكمي للمجموعات الضابطة والتجريبية.

كما هو موضح هنا ، يحتوي رأس سمكة الحمار الوحشي على عدد أكبر بكثير من الصواري العصبية مقارنة بالقسم الأوسط أو الذيل مع وجود منطقة الذيل التي تحتوي على أقل عدد من الأقنعة العصبية كما هو موضح في هذه اللوحة. نظرا لأن نمط الغرز في الرأس معقد وأكبر بكثير في عدد الأقنعة العصبية ، فإنه لم يصلح لمنطقة للتحليل الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، بغض النظر عن تركيز الجنتاميسين الذي تم اختباره ، نادرا ما كان الاستئصال الكامل للأقنعة العصبية في جميع أنحاء الرأس ممكنا ، مما ترك بقعا من الأقنعة العصبية لوحظت بعد علاج الجنتاميسين كما تم الإبلاغ عنه سابقا.

في المقابل ، يحتوي الذيل على قناعين عصبيين قليلين ، وعلى هذا النحو ، اخترنا منطقة منتصف الجسم لتحليل تجديد الصاري العصبي كميا. في البالغين في هذه المنطقة ، حددنا أربع غرز خلف الزعنفة الصدرية الجانبية كانت متسقة في عدد الصاري العصبي بين جميع البالغين. الأهم من ذلك ، تمكنا من استئصال الصواري العصبية في هذه المنطقة باستمرار وبشكل كامل من خلال علاج جنتاميسين بنسبة 0.004٪ على مدار 24 ساعة كما تم الإبلاغ عنه سابقا ، مما يسمح بتحديد دقيق لاحق لتجديد الصاري العصبي كما هو موضح في هذا الشكل ، تمت مراقبة التجديد بعد استئصال جميع الأقنعة العصبية داخل غرز منتصف الجسم الأربع بعد علاج جنتاميسين على مدار 24 ساعة وتم تحديد التجديد الإيجابي من خلال ظهور ما لا يقل عن ثلاثة صاري عصبي داخل غرزة بثماني ساعات بعد الجنتامايسين.

ما يقرب من ثلث الأسماك لديها بعض علامات التعافي. على الرغم من أنه كما هو موضح هنا ، كانت شدة الأورام العصبية باهتة في الغرز المتجددة. استمر عدد الصواري العصبية وشدتها في الزيادة بطريقة خطية حتى وصل التجديد إلى هضبة في 16 ساعة بعد الجنتامايسين.

إذا لم تكن النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل الأورام العصبية ذات دلالة إحصائية بين المجموعات الضابطة والتجريبية ، فيمكن للمرء توسيع هذه الدراسات إلى مستوى خلايا الشعر الفردية للحصول على درجة أعلى من الدقة للمقارنات الكمية في ثماني ساعات و 10 ساعات و 12 ساعة من وقت التجديد. وجدنا أن المجموعات الضابطة لديها نطاق من صفر إلى أربع خلايا شعرية لكل صاري عصبي في منطقة منتصف الجسم ، كما هو متوقع للمجموعات الضابطة عند التحليل الكمي. لم يتم الكشف عن أي فرق إحصائي بين الأورام العصبية من حيث خلايا الشعر لكل صاري عصبي في هذه النقاط الزمنية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تكون دائما على دراية بالوقت. لا تترك الأسماك في الجيناميسين لأكثر من 24 ساعة أو الصبغة الحيوية لأكثر من 75 دقيقة بعد نموها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي لاستكشاف تجديد الخط الجانبي في حالة مرضية مقارنة بالحالة الطبيعية ونموذج الزرد.