Name: تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج الزائفة الزنجارية استخدام ميني himar1 مارينر الطفرات ينقول بوساطة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: اكتشف تحديد الجينات المنظمة لإنتاج الألجينات في Pseudomonas aeruginosa باستخدام طفرات ينقول mini-himar1. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات تكوين الغشاء الحيوي والضراوة البكتيرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل الوطنية للملاحة الجوية والفضاء إدارة ولاية فرجينيا الغربية الفضاء غرانت اتحاد (ناسا WVSGC)، ومؤسسة التليف الكيسي (CFF-YU11G0) والمعاهد الوطنية للصحة وP20RR016477 P20GM103434 لشبكة فكرة ولاية فرجينيا الغربية للتميز بحوث الطبية الحيوية. نشكر Vonya M. Eisinger للمساعدة التقنية مع هذا العمل.

1. إعداد سلالات البكتيرية ومتحدر من والدين إختبارات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم E. القولونية SM10/λpir/pFAC في 5 مل من مرق لوريا (LB) تستكمل مع 15 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ومكان في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم P. الزنجارية سلالة PAO1 في 5 مل من LB، ومكان في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها في 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها وتخلط كميات متساوية من PAO1 وE. القولونية pFAC مثل أن الحجم النهائي بين 1-1،4 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خليط أجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، تجف لوحات LB للاقتران: ترك لوحات مفتوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كافة ولكن 50 ميكرولتر من طاف من خليط الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 50 ميكرولتر المتبقية من طاف وماصة على لوحة LB جافة في قطرة واحدة مدمجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية لوحة في غطاء الدخان لتجف (IMPORTANT ملاحظة: لا تدع خلايا موزعة على اللوحة، وهذا سوف يقلل بشكل كبير من كفاءة تصريف الافعال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الحبرية جافة، عكس لوحة LB واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن خليط الخلايا واحتضان، وإعداد كبيرة (150 OD × 15 مم) لوحات مع PIA 300 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. قبل الاستخدام، وإزالة أي الرطوبة المتبقية عن طريق وضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة من الخليط خلية كاملة، وجمع الخلايا باستخدام التلقيح حلقة عقيمة وفي أنبوب microcentrifuge تحتوي على 1 مل LB ودوامة، أو ماصة، لتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنتشر الخلايا بالتساوي على لوحات كبيرة تحتوي على PIA 300 ميكروغرام / مل جنتاميسين. (هام: للحصول على هذه الخطوة، فمن الأفضل لإضافة كميات متزايدة من خليط الخلية لفصل الصفائح (مثل لوحة 1: 10 ميكرولتر، لوحة 2: 50 ميكرولتر، لوحة 3: 100 ميكرولتر، لوحة 4: 500 ميكرولتر، الخ) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 37° C. </li></ol> 2. كشف وعزل المستعمرات موكويد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة ودراسة للمستعمرات مخاطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل مستعمرة مخاطي واحد ومتتالية للعزلة على لوحات صغيرة (100 OD × 10 ملم) مع PIA و 300 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.2 على الثقافة بين عشية وضحاها السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،2-2،4 مرتين أخريين لتحديد استقرار عزل مخاطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة عزل النهائي، تطعيم 4.5 مل من LB مع مستعمرة مخاطي واحد واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، والتسمية 3 أنابيب microcentrifuge لكل متحولة مخاطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اثنين من 1.25 مل aliquots من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 2 أنابيب لاستخراج الحمض النووي الجيني وتحديد الموقع ينقول الإدراج (انظر البروتوكول 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك، أرشفة كل متحولة مخاطي من قبل pipetting 1 مل الثقافة بين عشية وضحاها إلى appropriatcryovial المسمى اعل المحتوية على حجم مساو من 10٪ الحليب الخالي من الدسم. المحل في -86 درجة مئوية. </li></ol> 3. gDNA تقييد الهضم وربط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج gDNA من متحولة مخاطي باستخدام أي أسلوب المفضل (على سبيل المثال. الفينول كلوروفورم، عمود الدوران، الخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز gDNA، هضم ما مجموعه 2 ميكروغرام مع 1 ميكرولتر من نوكلياز داخلية تقييد سالي، 0.5 ميكرولتر من ألبومين المصل البقري، 5 ميكرولتر من العازلة سالي انزيم (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي MgCl 2 ، 1 ملم Dithiothrietol (DTT)، ودرجة الحموضة 7.9 في درجة حرارة الغرفة)، وحجم مناسب من DH 2 O لتحقيق إجمالي حجم 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم الحمض النووي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. (هام: اعتمادا على كفاءة انزيم التقييد، فإنه قد يكون من الضروري إضافة 1 ميكرولتر إضافية للهضم واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة هذا بالإضافة إلى ملخص ليلة وضحاها.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية DIGEالحمض النووي STED باستخدام أي أسلوب المفضل (مثل الاغاروز هلام تنقية، والأعمدة تدور) وأزل مع 25 ميكرولتر من العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate الحمض النووي يهضم عن طريق خلط 11 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى مع التركيز المفضل لل~ 10-20 نانوغرام / ميكرولتر، 1.5 ميكرولتر من العازلة ربط (330 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5 خلات، 660 ملي خلات البوتاسيوم، المغنيسيوم خلات 100 ملم، 5 ملم DTT)، 1.5 ميكرولتر من 100 ملي ATP و 1 ميكرولتر الحمض النووي يغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تعطيل انزيم التي يحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية. (ملاحظة: احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة أطول قد تزيد من نجاح عملية ربط). </li></ol> 4. العكسية PCR (iPCR) وتحليل تسلسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء iPCR على المنتج ربط باستخدام التالية إلى الأمام وعكس الاشعال والتدوير الحراري thermocycling الشروط: إلى الأمام التمهيدي (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA -عكسي التمهيدي (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA Thermocycler كونديستعقد: 1. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 2. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 3. 58 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 4. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 5. 72 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. 6. 10 ° C الانتظار. كرر الخطوات من 2-4 لمدة 34 دورات. (ملاحظة: يمكن تخزين المنتجات أسهب iPCR في 4 درجات مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الاغاروز الكهربائي للهلام لتأكيد نجاح iPCR التضخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التسلسل على المنتج iPCR باستخدام Gm3OUT وGm5OUT الاشعال. يتم تعيين موقع الإدراج وتوجه himar1 بها. </li></ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
<li>Franklin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AlgG+is+a+polymer+level+alginate+C5-mannuronan+epimerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase.</a> J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).</li>
<li>Franklin, M. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+analysis+and+cellular+localization+of+the+AlgI%2C+AlgJ%2C+and+AlgF+proteins+required+for+O+acetylation+of+alginate+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).</li>
<li>Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+algD+coding+for+GDPmannose+dehydrogenase+is+transcriptionally+activated+in+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).</li>
<li>Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis%3A+role+of+mucC+in+the+regulation+of+alginate+production+and+stress+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity.</a> Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).</li>
<li>Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+locus+determining+the+mucoid+status+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+AlgU+shows+sequence+similarities+with+a+Bacillus+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor.</a> J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+prediction+of+the+Crc+regulon+identifies+genus-wide+and+species-specific+targets+of+catabolite+repression+control+in+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria.</a> BMC Microbiol. 10, 300 (2010).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).</li>
<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

المؤلف هونغ وى D. يو هو موظف العلوم رئيس وأحد مؤسسي تكاثر مبكر تكنولوجيز، ذ.

من المهم أن نلاحظ أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في الأنواع الأخرى الزائفة مع هذه التعديلات: احتضان P. المتألقة وP. الكريهة عند 30 درجة مئوية، وP. الشتوتسرية في 42 درجة مئوية، P. stuzeri ينبغي مثقف على لوحات LB تستكمل مع 150 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين؛ على خطوة 1.11، P. ينبغي نقل الخلايا الشتوتسرية إلى 500 ميكرولتر من LB بدلا من 1 مل. بالإضافة إلى ذلك، هناك نوعان من الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول. أولا، يجب أن يكون مثقف سلال...

قدرة الانتهازية، الممرض سالبة الجرام الزائفة الزنجارية لتحفيزه على إنتاج الجينات هو أحد العوامل الرئيسية في قدرتها على إنشاء بيوفيلم. الافراط في الجينات هو النمط الظاهري غالبا ما يشار إليها باسم mucoidy. عزل مستعمرات مخاطية من sputa الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) يدل على وجود عدوى مزمنة، ويرتبط مباشرة مع الانخفاض العام في صحة المريض 1. حاليا، فمن المفهوم أن تنظيم وإنتاج الجينات في P. الزنجارية يحدث في المقام الأول على اثنين من operons. الأول هو الاوبرون السكروز الجينات، والذي يحتوي على 12 الجينات (algD - alg8 - alg44 - algK - الالم - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - الطحالب) التي هي المسئولة عن تصنيع وتصدير البوليمر الجينات عبر والجبلة المحيطية إلى خارج الخلية environmeالإقليم الشمالي 2-5. والاوبرون الثاني هو مجموعة من الجينات التي تبدأ مع عامل سيغما بديل ALGU / T والمستمر مع mucA، mucB، وmucD. ALGU / T هو منظم إيجابية، في حين تصنف mucAB-D كما المنظمين السلبية لإنتاج الجينات 6-8. بالإضافة إلى ذلك، والمنظمين النسخي، مثل AlgB، AlgQ، الغر، وRpoN، وكذلك في مرحلة ما بعد النسخي وتعديل آخر متعدية عن طريق التحكم القمع مقيضة، والنشاط كيناز (KinB) والتحلل البروتيني intramembrane، وأيضا ثبت أن تشارك في الجينات تنظيم 9-14. تم إنشاء ينقول ناقلات صغيرة himar1 المعروفة باسم pFAC أصلا في مختبر الدكتور Mekalanos &#39;في كلية هارفارد الطبية 15. يتكون البلازميد pFAC عنصر القابلة للنقل يحيط بها اثنان يكرر مقلوب من 27 نقطة أساس وكاسيت الجنتاميسين المقاومة في الوسط (aacC1: 534 بي بي)، جين ترميز hyperactإيف transposase مارينر 16، والجينات ترميز β-اكتاماز (بلوخ) (الشكل 1). تسلسل المعلومات عن العنصر القابلة للنقل من pFAC متاح في عدد انضمام بنك الجينات: DQ366300 13. في pFAC، هناك موقع استنساخ متعددة (MCS) وراء الجينات aacC1 والذي يستخدم لتحديد موقع الإدراج الكروموسومات باستخدام العكسية PCR. واحدة ميزة كبيرة مع استخدام ينقول مصغرة himar1 هو ليس هناك حاجة لعوامل المضيف محددة للتبديل (الطفرات). بالإضافة إلى ذلك، هناك وفرة عالية من TA المواقع الإدراج ثنائي النوكليوتيد جدت في جميع أنحاء الجينوم من P. الزنجارية. على سبيل المثال، TA المواقع ثنائي النوكليوتيد الإدراج يحدث و94404 100229 مرات في PAO1 (6264404 بت في الثانية، بنك الجينات عدد الانضمام NC_002516.2) وPA14 (6537648 بت في الثانية؛ رقم الوصول بنك الجينات NC_008463) الجينوم، على التوالي. بسبب وفرة من TA ثنائي النوكليوتيد في الجينوم، ميني himar1 </em&gt; ينقول يمكن أن يسبب عالية الكثافة والطفرات العشوائية، والتي هي مناسبة خاصة لتحليل الجينات الفوعة والجينات التي تنظم للغاية. نظريا، يمكن للينقول مصغرة himar1 إدراجها في أي الجينات غير الضرورية داخل جينوم P. الزنجارية. وهذا يوفر مواقع الإدراج TA حوالي 18 في إطار القراءة المفتوح في الجينوم PAO1. هنا، نحن تصف البروتوكول باستخدام مصغرة himar1 بوساطة الطفرات ينقول لتحديد المنظمين رواية mucoidy في P. الزنجارية. وبشكل أكثر تحديدا، ونحن مترافق biparentally متجه pFAC تحتوي على ينقول مصغرة himar1 من E. القولونية SM10/λpir في nonmucoid أنموذجية التغذي سلالة PAO1. بعد دمج ينقول في الجينوم، سلالة المتلقي هو مثقف على الزائفة عزلة أجار (PIA) التي تحتوي على التريكلوسان الذي يمنع نمو E. القولونية. وبالتالي، مكتبة من المسوخ من <em&gt; P. يمكن اختيار الزنجارية من النمو على PIA وحة تستكمل مع الجنتاميسين وجود النمط الظاهري مخاطي. ملاحظة، صحيح سوف مقابل ومتحولة التكامل بوساطة ينقول يكون النمط الظاهري المقاومة والحساسة للكربنيسيلين الجنتاميسين. في هذه الدراسة، تم عزل ما يقرب من 80،000 من المسوخ الإدراج PAO1 من خلال أربعة الإقتران منفصلة. نحن بعد ذلك فرزها لعزلات مخاطي، وتحديد موقع من قبل الإدراج تقييد انزيم الهضم، وربط والعكسية PCR. أجرينا تحليل لطخة الجنوبية باستخدام المقاومة كاسيت الجنتاميسين كما تحقيقا لرؤية عدد من الإدراج في الجينوم. توصلنا إلى أن أكثر من 90٪ من المسوخ التي تم الحصول عليها في الاقتران باستخدام هذا البروتوكول لم يحصل إلا على نسخة واحدة من himar1 في الجينوم وعرض النمط الظاهري المقاومة والحساسة للكربنيسيلين الجنتاميسين. وقد تم تحديد ما مجموعه 32 عزلات مخاطي، تم تعيين 22 منهم إلى مواضع مختلفة من P. الزنجارية PAO1كروموسوم. هذا المعدل من الإدراج توفر تغطية كافية لتحديد العديد من المنظمين رواية من الإفراط الجينات.

<table><tbody><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>عبر Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas عزل أجار</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>عبر Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Small Plates (100 OD × 10 مم)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>لوحات كبيرة (150 OD × 15 مم)</td><td>فيشر سيانتيفيك</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>جلسرين</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة اهتزاز منضدة</td><td>نيو برونزويك Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة</td></tr><tr><td>حاضنة الخزانة</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>جهاز الطرد المركزي</td> الدقيق <td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>عبر مقياس الطيف الضوئي Bio-Rad</td></tr><tr><td></td><td></td><td>170-2525</td><td>أو الطريقة / البائع</td></tr> <tr><td>المفضلحلقات التلقيح القابلة للانعفاء</td><td>فيشر سيانتيفك</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1.5 مل أنابيب الطرد المركزي</td> الدقيقة <td>فيشر ساينتفيك</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0 مل قوارير مبردة</td><td>كورنينج</td><td>430659</td><td>عبر فيشر ساينتفيك</td></tr><tr><td>15 مل أنابيب</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>05-539-12</td><td></td></tr> حليب <tr><td>خالي الدسم</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>عبر فيشر Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy الدم والأنسجة (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>أو الطريقة المفضلة / البائع</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td> <td>Qiagen</td><td>28106</td><td>أو الطريقة المفضلة / البائع</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250) &nbsp ؛</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>أو الطريقة المفضلة / البائع</td></tr><tr><td>FastLink II DNA Ligation Kit</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>عبر Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td></td><td>Labnet NC0205808</td><td>عبر Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1 ، تقييد نوكلياز</td><td>داخلي New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>عبر Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler ، Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>جينيميت</td><td>3120-500</td><td>عبر فيشر ساينتفيك</td></tr><tr><td>جنتاميسين كبريتات</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 مل قوارير مبردة</td><td>كورنينج</td><td>430659</td><td>عبر فيشر ساينتفيك</td></tr></tbody></table>

تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; استخدام ميني<em&gt; himar1</em&gt; مارينر الطفرات ينقول بوساطة

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

الزائفة الزنجارية هي سالبة الجرام، بكتيريا البيئية مع قدرات التمثيل الغذائي تنوعا. P. الزنجارية هو الممرض الانتهازية البكتيرية التي تنص على الالتهابات الرئوية المزمن في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). الافراط في السكاريد المحفظة تسمى الجينات، والمعروف أيضا باسم mucoidy، ويشجع على تشكيل الأغشية الحيوية مخاطي التي هي أكثر مقاومة من خلايا العوالق للعلاج الكيميائي للمضادات الحيوية ودفاعات المضيف. بالإضافة إلى ذلك، التحويل من nonmucoid إلى النمط الظاهري مخاطي هو علامة السريرية لظهور عدوى مزمنة في CF. الإفراط الجينات التي كتبها P. الزنجارية هي عملية ماص للطاقة التي ضرائب ثقيلة على الطاقة الخلوية. لذلك، يتم تنظيم الجينات في إنتاج عالية P. الزنجارية. من أجل فهم أفضل تنظيم الجينات، وصفنا بروتوكول باستخدام مصغرة himar1 ينقول الطفرات لتحديد الجينات منظم الروايةق في سلالة PAO1 prototypic. يتكون هذا الإجراء من خطوتين أساسيتين. أولا، ونقل ينقول مصغرة himar1 (pFAC) من المضيف E. القولونية SM10/λpir إلى المتلقي P. الزنجارية PAO1 عبر اقتران متحدر من والدين لإنشاء مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج، والتي تم اختيارها على لوحات الزائفة عزلة أجار تستكمل مع الجنتاميسين. ثانيا، نحن فحص وعزل مستعمرات مخاطية لرسم خريطة للموقع من خلال الإدراج العكسية PCR باستخدام بادئات الحمض النووي لافتا إلى الخارج من الكاسيت الجنتاميسين وتسلسل الحمض النووي. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا اثنين من المنظمين رواية الجينات، mucE (PA4033) وkinB (PA5484)، في سلالة PAO1 مع البرية من نوع mucA ترميز عامل مكافحة سيغما MucA للسيد الجينات منظم ALGU (AlgT، σ 22) . يمكن تعديل هذا البروتوكول الطفرات الإنتاجية العالية لتحديد الجينات الأخرى ذات الصلة الفوعة تسبب تغيير في كولونيويورك التشكل.

كما هو موضح في الشكل 1، وبحار ينقول ناقلات صغيرة himar1، pFAC، يحتوي على اثنين من 27 سنة مضت يكرر مقلوب مع مواقع الإدراج TA المرافقة المقاومة aacC1 الجنتاميسين كاسيت، مع σ المروج 70 التابعة لها، وموقع الاستنساخ متعددة (MCS). بالإضافة إلى ذلك، يحتوي pFAC ناقلات الجينات ترميز transposase نشطة للغاية himar1، β-اكتاماز (جيش تحرير بلوشستان)، ونقل الاوبرون هيئة تنظيم الاتصالات. المواقع الإدراج TA تسمح للتكامل فعال ...

نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام بحار بوساطة الطفرات ينقول مصغرة himar1 لتوليد مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج إلى الشاشة، وعزل وتحديد الجينات رواية المنظمين في prototypic الزائفة الزنجارية سلالة PAO1.

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد جينات جديدة مرتبطة بإنتاج متعدد السكاريد الخارجي alginate في بكتيريا pseudomonas aerogen باستخدام الطفرات الموجهة بواسطة ترانسبوزون mini hamar one. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية مستنبتين منفصلتين طوال الليل من السلالة المانحة، e coli Lambda P الحاملة لبلازميد PAC، والخلايا المستقبلة pseudomonas aerogen، PAO one. بعد ذلك، يتم إجراء اقتران لبلازميد PAC عن طريق الزراعة المشتركة لـ e coli Lambda peer مع pseudomonas aerogen.يتم اختيار PAO one والاقترانات الناقلة على أغار عزل الزوائف (pseudomonas isolation agar)، ثم تُحدد المستعمرات الملونة وتُعزل على أطباق PIA. وأخيراً، يتم تحديد موقع واتجاه mini he mar one transpose في موقع الإدراج ضمن جينوم pseudomonas aerogen PAO one. وفي النهاية، يساهم استخدام الطفرات الموجهة بواسطة mini he R one transpose on في تحديد وتوصيف الجينات المرتبطة بإنتاج الألجينات في pseudomonas aerogen.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات الميكروبيولوجيا وعلم الوراثة البكتيرية، مثل تحديد المواقع الجينية المشاركة في تنظيم الوظائف الخلوية المختلفة التي توضح أن الإجراء سيتم تشغيله بـ withers. طالب دراسات عليا من مختبري، يحتوي ناقل P fac لـ mini he R one Mariner transpose على تكرارات معكوسة بطول 2 27 زوج قاعدة مع مواقع إدراج TA تحيط بـ A CC one Gentamycin resistance cassette مع محفز تابع لـ Sigma 70 يقع في الجزء العلوي من موقع استنساخ متعدد. كما يحتوي ناقل PFAC أيضاً على جينات تشفر لـ he R one transposes عالي النشاط وbeta-lactamase وعملية النقل TRA transfer.تسمح مواقع إدراج TA بالتكامل الفعال في جينوم سلالات pseudomonas aerogen. وتعد الدقة في تحديد واختيار طفرات OID أمراً بالغ الأهمية للنجاح العام في تحديد مواقع الجينات المشاركة في تنظيم الألجينات. لتحضير السلالات البكتيرية، ابدأ بتلقيح e coli SM 10 Lambda peer P fac في خمسة ملليلترات من lb، مدعمة بـ 15 µg/mL من Gentamycin، ثم ضعها في حاضنة هزازة طوال الليل عند 37 °C في اليوم نفسه.قم بتلقيح سلالة posa PO one في 5 mL من وسط LB وضعها في حاضنة هزازة طوال الليل عند 42 °C. في اليوم التالي، قم بقياس OD 600 للمزارع التي نمت طوال الليل، وامزج كميات متساوية من PAO one و E coli P fac، بحيث يكون الحجم النهائي بين 1 mL و 1.4 mL. قم بطرد الخليط مركزياً عند 6,000 ×g لمدة خمس دقائق.في هذه الأثناء، يتم تجفيف أطباق LB المخصصة لعملية الاقتران بتركها مفتوحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. يتم التخلص من جميع السائل الطافي من خليط الخلايا باستثناء 50 µL. ثم يتم إعادة التعليق.قم بتعليق كتلة الخلايا في الـ 50 microliters المتبقية من السائل الطافي، ثم انقلها بواسطة الماصة إلى طبق LB جاف. ضع الطبق بعناية داخل خزانة استخلاص الأدخنة للتجفيف بحيث تظل العينة في قطرة واحدة متماسكة. احرص على عدم انتشار الخلايا فوق سطح الطبق.سيؤدي ذلك إلى خفض كفاءة الاقتران بشكل كبير. وبمجرد جفاف القطيرة، اقلب طبق LB واحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات أثناء حضانة الخليط الخلوي. قم بتحضير أطباق agar لعزل Pseudomonas أو أطباق PIA تحتوي على 300 micrograms per milliliter من gentamycin.بعد التحضين، استخدم عروة تلقيح معقمة لجمع هذه القطرة الواحدة من الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 mL من وسط LB، ثم استخدم جهاز الدوامة (vortex) أو الماصة للمزج جيداً قبل توزيع الخلايا بالتساوي على أطباق PIA الكبيرة. حضّن الأطباق طوال الليل عند 37 °C. أخرج الأطباق من الحاضنة وافحصها بحثاً عن مستعمرات OID.اعزل مستعمرة moid واحدة وقم بتخطيطها للعزل على أطباق صغيرة تحتوي على PIA و300 micrograms per milliliter من Gentamycin. في اليوم التالي، اعزل مستعمرة moid واحدة وكرر عملية التخطيط. كرر عملية عزل المستعمرة الواحدة مرتين إضافيتين لتحديد مدى استقرار عزل moid بعد عملية العزل الأولية.قم بتلقيح 4.5 مل من وسط LB بمستعمرة واحدة من OID واحضنها في هزاز طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي، قم بتمييز ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة لكل طفرة OID. قم بتحضير حصتين بحجم 1.25 مل من المزرعة الليلية لاستخلاص DNA الجينومي وتحديد موقع إدراج الترانسيبوزون.بالإضافة إلى ذلك، يتم أرشفة كل طفرة OID عن طريق نقل 1 mL من المزرعة الليلية إلى أنبوب حفظ بالتجميد (cryo vial) مُسمى بشكل مناسب ويحتوي على حجم مساوٍ من skim milk بتركيز 10%. تُخزن الأنابيب عند درجة حرارة -86 °C. بعد استخلاص GDNA من طفرة MOID.باستخدام أي طريقة مفضلة وتحديد تركيزه، قم بهضم إجمالي 2 µg باستخدام 1 µL من إنزيم القطع Endonuclease S one في حجم كلي قدره 50 µL طوال الليل عند 37 °C. وبمجرد تنقية الـ DNA المهضوم باستخدام أي طريقة مفضلة في حجم كلي قدره 25 µL، قم بتجهيز تفاعل ربط باستخدام حوالي 11 µL من الـ DNA واحضن الخليط لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتثبيطه عند 70 °C لمدة 15 دقيقة، وأجرِ تفاعل IPCR على ناتج الربط باستخدام البادئات الأمامية والعكسية وظروف الدورة الحرارية التالية.ثم يتم التحقق من التضخيم باستخدام هلام AROS قبل استخدام بادئات GM three out وGM five out في النهاية لإجراء تسلسل للتفاعل. تظهر في هذا الشكل أمثلة على عزلات MOID وعزلات غير MOID. وبناءً على البروتوكول الموضح في هذا الفيديو، يجب أن ينتج عن كل عملية اقتران مجموعة من حوالي 20,000 طفرة موزعة على 15 إلى 20 طبقاً كبيراً بسبب الإنتاج المفرط للألجينات.يجب أن تكون مستعمرة العفن شفافة أو بيضاء اللون وذات مظهر كريمي أو لزج. إذا كانت عملية الطفرات وتضخيم DNA ناجحة، فيجب أن يظهر نطاق تضخيم واحد بالحجم المناسب كما هو موضح في هذا الشكل. هناك غياب لنطاق تضخيم IPCR في PAO one.ومع ذلك، فقد رصدنا قطعة تضخيم واحدة يبلغ طولها حوالي 1,400 زوج قاعدي وحوالي 1000 زوج قاعدي في PA, O one VE two و PA O one VE 13 على التوالي. ويتوافق حجم قطع التضخيم هذه مع إدراج transposon HE R one mariner في منطقة المحفز لـ PA 4 0 3 3 في PA oh one VE two، وداخلياً في PA 5 4 84 في PA oh one VE 13. ويمكن استخدام DNA الجينومي لـ PA oh one الذي خضع لعمليتي الهضم التقييدي والربط كعنصر تحكم سلبي.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاثة أو أربعة أيام إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر تحضين السلالات البكتيرية في درجة الحرارة المناسبة قبل عملية الاقتران الأبوي الحيوي.

identification-novel-genes-associated-with-alginate-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

القدرة على إنتاج لالجينات...

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

ويمكن استخدام منهجية واسعة النطاق الاصطناعية الوراثية شاشات التفاعل (الجينات الجين أو قشوة) لاستكشاف التكرار الجيني وعبر مسار الحديث. ووصف eSGA هنا، نحن تصف عالية الإنتاجية الكمية الاصطناعية الفحص الجيني مجموعة التكنولوجيا، التي قمنا بتطويرها لتوضيح العلاقات واستكشاف روكبي شبكات التفاعل الوراثية...

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

الأمعائية س. YSU تنمو في الجلوكوز الحد الأدنى من الأملاح المتوسطة. يتم إنشاء Auxotrophs عن طريق تحويل ذلك مع transposome الذي إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف. تم العثور على المسوخ بواسطة الطلاء المتماثلة من المتوسطة معقد إلى الحد الأدنى من المتوسط. يتم تحديد جينات الانقاذ توقفت بسبب الجينات وتسلسلها.

جيل من الأمعائية س. YSU Auxotrophs عن طريق الطفرات ينقول

هنا ، ونحن وصف بروتوكول بسيطه وقابله للتكرار من نموذج الماوس للعدوى لتقييم توهين السلالات المعدلة وراثيا من الزائفة الزنجاريه بالمقارنة مع الولايات المتحدة الغذاء والدواء أداره (FDA)-التي وافقت علي القولونية للتطبيقات التجارية.

جيل من المتحولين في الإطار الجينات الحذف في الزائفة الزنجاريه واختبار لتوهين ضراوة في نموذج الماوس بسيطه من العدوى

نحن وصف طريقة لتوليد مكتبات متحولة تشبع transposon في البكتيريا السلبية الغرام وإعداد لاحقة من مكتبات ابيرليكون الحمض النووي لتسلسل عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، ونحن نركز على مسببات الأمراض ESKAPE، Acinetobacter baumannii، ولكن هذا البروتوكول هو قابل لمجموعة واسعة من الكائنات الحية سلبية الغرام.

توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية

هذه طريقة مكيفة لتحديد عوامل استعمار الحشرات المرشحة في سيمبيونت مفيد Burkholderia. يتم إصابة مضيف الخنفساء بمكتبة متحولة عشوائية تم إنشاؤها عبر تولد الإرسال والاستقبال ، ويتم مقارنة تعقيد المكتبة بعد الاستعمار بعنصر تحكم ينمو في المختبر.

تسلسل إدراج الإرسال والاستقبال كأداة لتوضيح عوامل الاستعمار البكتيرية في بيركهولدريا غلاديولي سيمبيونت من خنافس لاغريا فيلوسا

هنا ، نصف بناء طفرات فارغة من Aeromonas في جليكوزيل ترانسفيراز محددة أو مناطق تحتوي على جليكوزيل ترانسفيراز ، ومقايسات الحركة ، وتنقية السوط التي أجريت لتحديد مشاركة ووظيفة إنزيماتها المشفرة في التخليق الحيوي للجليكان ، وكذلك دور هذا الجلايكان في التسبب البكتيري.

توليد الطفرات الخالية لتوضيح دور الجليكوسيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية

يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

تحدد هذه الدراسة إطارا لتطوير نموذج غشاء حيوي متعدد الميكروبات الكلي وتحسين بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي لتقييم التعبير الجيني Pseudomonas aeruginosa الذي يعكس بيئة الرئة للتليف الكيسي. تشمل التطبيقات تقييم التأثيرات المضادة للميكروبات ودراسة بدائل المضادات الحيوية في ظل الظروف ذات الصلة بالتليف الكيسي.

نموذج الأغشية الحيوية المجمعة للتليف الكيسي لدراسة التعبير الجيني المرتبط بالعدوى

اكتشف تحديد الجينات المنظمة لإنتاج الألجينات في Pseudomonas aeruginosa باستخدام طفرات ينقول mini-himar1. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات تكوين الغشاء الحيوي والضراوة البكتيرية.

تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج

استكشف المزيد من الفيديوهات