القبض على ببتيد سكري لخلية سطح البروتينات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثراء بروتينات غشاء سطح الخلية منخفضة الوفرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تغيير طبيعة بروتينات الغشاء وهضمها أولا. الخطوة الثانية هي أكسدة الجليكان والتقاط الببتيدات الغليكوزيلية على سطح الراتنج.

ثم يتم غسل الببتيدات غير السكرية من الراتنج. الخطوة الأخيرة هي إطلاق جليكوببتيدات N المرتبطة من الراتنج لتحليل LC MS. في النهاية ، يمكن تعيين تسلسل الببتيد المحدد مرة أخرى إلى البروتينات لأغراض التحديد والقياس الكمي.

سأوضح لك اليوم كيف يعمل التقاط الببتيد Geico ral. الميزة الرئيسية لهذه التقنية الجرعة الزائدة ، مثل الجرعات الزائدة ، مثل التقاط البروتين السكري ، هي أنه سيتم أولا هضم البروتين الغشائي ويمكن إجراء التقاط الجليكوببتيد في وعاء واحد. يمكن أن يمتد تطبيق هذه التقنية إلى اكتشاف المؤشر الحيوي للمرض.

نظرا لأنه يمكن إفراز بروتين التمساح في الدم وسوائل الجسم الأخرى ، ويمكن استخدام البروتين السكري المتداول في الدم ، وهو خاص بالعملية المرضية ، كمؤشرات حيوية للتشخيص والتشخيص. أولا ، قم بإعداد أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت منخفض التوتر مع كوكتيل مثبط للبروتياز واحد إلى 100. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت منخفض التوتر إلى حبيبات خلية تحتوي على ما يقرب من 10 إلى الخلايا الثامنة ، واحتضان الخليط لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الجليد ، انقل الخلايا إلى قارورة ملليلتر وقمل الخلايا عن طريق تمرير العينة من خمس إلى 10 مرات من خلال إبرة حقنة.

ثم استخدم مقياس الخلوي الدموي وتلوين التريان الأزرق. للتحقق من كفاءة التحلل ، امزج المليلتر الواحد مع ثلاثة ملليلتر من بقايا المخزن المؤقت منخفض التوتر. قم بتدوير الأنبوب عند 3000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

انقل المادة الطافية الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي فائق وقم بتخزين الحبيبات في فريزر سالب 80 درجة مئوية. قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي الفائق عند 100 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بإذابة الجزء الميكروصومي في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتمسخ ، ثم قم بغلي المحلول عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد تبريد المحلول الساخن إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف مسحوق اليوريا عالي النقاء لإعطاء تركيز نهائي ثمانية مولات واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 500 ملليمول. أنا oto محلول مخزون الأسيتاميد للعينة لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 15 ملليمول.

ثم احتضان المحلول في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لألكل الثيول الحرة في العينة. بعد ذلك ، أضف محلول مخزون DTT المولي إلى العينة لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 10 ملليمولار واحتضان المحلول لمدة 10 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة. لإخماد الأسيتاميد المفرط ، قم بتخفيف المحلول الذي تم الحصول عليه 10 مرات باستخدام 40 مليمولار ثلاثية المخزن المؤقت عند درجة الحموضة ثمانية ، ثم أضف التربسين إلى العينة بنسبة واحد إلى 20 من التربسين إلى كمية البروتين الإجمالية.

احصل على كمية البروتين الكلي باستخدام مقايسة برادفورد. حافظ على تفاعل الهضم في فرن 37 درجة مئوية طوال الليل لضمان اكتمال التفاعل. عند الانتهاء ، قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تحمض محلول العينة إلى درجة الحموضة الأولى مع حمض الهيدروكلوريك 10 مللي مولار ، وهي حالة تتحلل أيضا بشكل أسرع.

ثم يتحلل المنظف بشكل أسرع عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في حاضنة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الترسيب المطور عن طريق الطرد المركزي بعد الطرد المركزي. قم بتنظيف SUP natin الذي يحتوي على ببتيدات العينة بواسطة خرطوشة استخراج الطور الصلب C 18 وجفف العينة التي تم الحصول عليها عن طريق سرعة التفريغ.

قم بإجراء تحليل صفحة SDS للعينات قبل وبعد الرحلات والهضم لتأكيد كفاءة الهضم. في هذه المرحلة ، قم بإذابة الببتيدات التي تم تنظيفها في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوصيل. بعد إضافة نقاء الصوديوم إلى محلول الببتيد لإعطاء تركيز نهائي 10 مللي مولار.

احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة عند اكتمال الحضانة ، قم بإخماد الطبقة الزائدة بكبريتيت الصوديوم لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمولار ودرجة حموضة خمسة بعد الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أدخل 200 ميكرولتر من محلول راتنج مشتق من الخلايا المائية ، ومخزن مؤقت متوازن ومقران في محلول الببتيد. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين مع الدوران من طرف إلى طرف للاقتران الكامل. عند الانتهاء ، قم بإزالة الببتيدات غير المرتبطة عن طريق غسل الراتنج مرتين بمليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات ، ومليلتر واحد من 1.5 مولار كلوريد الصوديوم ، ومليلتر واحد من الميثانول ، ومليلتر واحد من 80٪ أسيتو نتريل.

بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية والغسالات لتحليل الببتيدات غير المرتبطة. قم بتخزين العينات في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التحليل. ثم اغسل الراتنج ثلاث مرات بمليلتر واحد من بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مولار عند درجة الحموضة ثمانية.

أخيرا ، أضف 300 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم إلى قارورة العينة. لتحرير N glycopeptides من الراتنج. أضف PNG ACE F واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية مع دوران من طرف إلى طرف.

بعد ذلك ، اجمع الببتيدات التي تم إطلاقها عن طريق الطرد المركزي ، ثم اغسل الراتنج بمليلتر واحد من 80٪ أسيتيل النتريل. امزج الغسيل مع ما تم جمعه مسبقا. أخيرا ، جفف الحل الذي تم الحصول عليه في سرعة VAC لتحليل LC MS.

يظهر طيف الببتيد الجليكوبتيد غير النمطي المأخوذ بعد طريقة التخصيب هنا في الجليكوببتيد الذي تم الحصول عليه. تمت إزالة الجليكان n وتم تحويل الجليكان المرفق إلى حمض سبارتيك بواسطة P-N-G-A-F. لذلك ، يمكن البحث عن الطيف بسهولة بواسطة أي محرك بحث بروتيني مقابل قواعد بيانات تسلسل البروتين الشائعة.

LC MS غير النمطية. تظهر هنا نتيجة n glycopeptides التي تم التقاطها حيث يمكن تحديد أكثر من 100 بروتين سكري من تشغيل LC MS واحد لجزء ميكروسومي للخلية. انتقائية التخصيب لكل من البروتينات السكرية والجليكوببتيدات هي بشكل عام أكثر من 90٪ يمكن أن يكون للتحليل الناجح انتقائية تخصيب بنسبة 95٪ باستخدام عمود SCX وتدرج خطوة لمزيد من التجزئة. عادة ما تضاعف العينات السابقة لتحليل LCMS عدد تحديدات البروتين السكري.

في بعض الأحيان عندما تكون كمية الجليكوببتيدات التي تم الحصول عليها منخفضة ، يمكن ملاحظة الشوائب المتراكمة من القوارير في العينة النهائية. يمكن إزالة هذه الملوثات بواسطة عمود MCX. لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، أتمنى أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام طرق التقاط الببتيد السكرية لدراسة بروتين غشاء الخدمة الذاتية.

أثناء محاولة هذا البروتوكول ، من المهم أيضا تخصيص عينات لكل خطوة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. يمكن أيضا تحسين حجم الكاشف لدراستك المحددة.