الليزر التي يسببها انهيار الطيفي: نهج جديد لرسم الخرائط جسيمات متناهية الصغر والكمي في الجهاز الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم طريقة بسيطة وقوية لرسم خرائط وتقدير كمية العناصر العضوية وغير العضوية في الأنسجة البيولوجية باستخدام أجهزة مكتبية متوافقة تماماً مع المجهر الضوئي التقليدي. ويتم تحقيق ذلك من خلال تركيز نبضة ليزر على العينة المعنية لبدء تكسير المادة وإحداث شرارة فيها، حيث تطلق البلازما إشعاعاً يتم تحليله لاحقاً بواسطة مطياف.

تتمثل الخطوة الثانية في اختيار وتحديد الخطوط الطيفية المقابلة للعناصر المستهدفة ومسح سطح العينة. بعد ذلك، تُجرى قياسات المعايرة للسماح بتحديد التركيزات العنصرية. وتتمثل الخطوة النهائية في بناء الخريطة العنصرية لأنسجة العينة من جميع الأطياف المسجلة باستخدام مقياس الشدة النسبية أو مقياس التركيز.

في نهاية المطاف، يُستخدم مطياف الانهيار المستحث بالليزر لتوضيح التوزيع النسيجي للعناصر المختلفة دون الحاجة إلى أي وسم. ومقارنةً بالطرق الحالية الأخرى، مثل الفلورة الدقيقة بالأشعة السينية أو التقنيات القائمة على مطياف الكتلة، فإن مطياف الانهيار المستحث بالليزر (LIBS) بسيط التنفيذ، ويعمل تحت الضغط الجوي، ويتوافق مع معظم أنظمة المجهر الضوئي.

بالإضافة إلى ذلك، تتيح هذه الطريقة الوصول إلى مستوى حساسية PPM وبدقة تصل إلى الميكرون. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على سؤال محوري في تكنولوجيا النانو المطبقة على الدراسات البيولوجية، مثل توزيع الجسيمات النانوية التي تحتوي على عناصر معدنية داخل عينة نسيجية دون الحاجة إلى وسم الجسيمات النانوية. كما يمكن أن تمتد هذه التقنية لتشمل علم الأمراض نظراً لحد الكشف المنخفض لديها في رصد العناصر المعدنية غير الطبيعية مثل النحاس والحديد والألومنيوم التي قد تتواجد في أعضاء مختلفة من الجسم، وخاصة الدماغ. ومن خلال هذه الطريقة، يمكن توفير رؤى دقيقة حول الكشف عن الجسيمات النانوية وتحديد هويتها.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى، مثل الكشف عن العناصر غير العضوية في TCU أو توزيع العناصر غير المتجانسة. وسيتعين على العلماء الذين سيجرون مثل هذه التجارب التعامل بدقة مع إعدادات الاستحواذ من أجل الحصول على أقوى إشارة ممكنة دون إلحاق ضرر كبير بالعينات. ابدأ التجربة بتحضير شرائح العينات المراد دراستها وفقاً لهذا البروتوكول.

يتم الحصول على الأعضاء من الفئران الحاملة للأورام، والتي حُقنت بمحلول جسيمات الجادولينيوم النانوية، وذلك لتحضير الشرائح. توضع شرائح من الأعضاء بسمك 100 micrometer على شريحة كوارتز أو في طبق بتري. تُخزن الشرائح دائمًا في درجة حرارة -80 °C.

بعد ذلك، قم بتحضير عينات المعايرة. ضع ملصقات على عدة قوارير موضحاً عليها التركيزات، بدءاً من zero nanomolar وصولاً إلى five millimolar. ولكل قارورة، قم بتحضير 100 µL من خليط الجادولينيوم في الماء بالتركيز المناسب.

بمجرد الانتهاء من ذلك، قم بتجهيز شريحة. قم بقياس 5 µL من القارورة الأولى وضعها على شريحة الكوارتز أو طبق بتري. تأكد من تمييز القطرة لاستخدامها لاحقاً.

تحرك مسافة ثلاثة مليمترات على طول المحيط وضع 5 µL من التركيز التالي على الشريحة. كرر هذه العملية مع كل محلول من المحاليل المتبقية. اترك محتويات الشريحة لتجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

يستخدم هذا الإعداد الليزري ليزر نيوديميوم-ألومنيوم-جارنيت نانو-ثانية ينتج شعاعاً بطول موجي 1064 نانومتر. استخدم جزءاً من الشعاع لمزامنة نظام المطياف. ووجه الجزء الآخر عبر مخفف يتم التحكم فيه بواسطة الحاسوب، ويُستخدم لضبط وتثبيت طاقة نبضة الليزر طوال التجربة.

بعد ذلك، وجّه الحزمة إلى منطقة العينة هناك. ركز الحزمة على منصة الإزاحة التي يتم التحكم فيها بواسطة البرنامج. ستقوم هذه المنصة بحمل حامل العينة، مع استخدام كاميرا CCD واحدة لمراقبة سطح حامل العينة.

وجهاز آخر لمراقبة ريشة البلازما. يتم تحليل الضوء الناتج عن تفكك العينة باستخدام مطياف ذو شبكة دوارة مع كاميرا ICCD يتم تبريدها عند درجة حرارة -26 درجة Celsius. ومن أجل القياس، ابدأ في تثبيت الليزر وتبريد الكاميرا عند درجة حرارة -26 درجة Celsius.

قبل 10 دقائق من بدء التجربة. عند الجاهزية، استخدم الموهن لتثبيت طاقة النبضة عند 5 millijoules. بعد ذلك، أحضر شريحة العينة المراد دراستها واستعد لتثبيتها على منصة العينة.

قم بتثبيت العينة على حامل العينات الآلي. بمجرد الانتهاء من ذلك، عد إلى جهاز الكمبيوتر. ولتحديد موضع العينة، حرك المنصة بحيث يقع جزء من العينة في مسار شعاع الليزر.

اضبط بؤرة الليزر لتكون على عمق حوالي 100 micrometers تحت سطح العينة. عند القيام بذلك، يشكل الليزر فوهات بقطر 50 micrometers أو أقل. استخدم الكمبيوتر لضبط قيمة شق إدخال المطياف على 40 micrometers ومعلمات ICCD لقياس التعيين الخرائطي.

اضبط موضع الحامل لاستهداف منطقة من العينة. التقط صورة بانورامية عالية الدقة للعينة باستخدام مصدر ضوء واسع الطيف. بعد ذلك، استخدم البرنامج والصورة الملتقطة لتحديد منطقة مسح LIBS ودقتها.

هنا تكون الشبكة بأبعاد 100 في 100 مع وجود مسافة 100 micrometers بين النقاط. ابدأ عملية الاستحواذ الآلي للبيانات عند كل نقطة في الشبكة، حيث يتم قياس الطيف وتسجيله في ملف.

عندما تنتهي القياسات في غضون 30 دقيقة تقريبًا، التقط صورة ثانية لشريحة العينة، ثم قم بتجميع جميع الأطياف في ملف بيانات واحد لاستخدامه لاحقًا. بعد ذلك، أخرج شريحة العينة واستعد لتركيب عينات المعايرة. قم بتثبيت شريحة الكوارتز التي تحتوي على عينات المعايرة على منصة النقل عند جهاز الكمبيوتر.

ضع مركز عينة المعايرة الأولى في مسار الليزر. حافظ على بارامترات التجربة وسجل طيفاً. كرر هذه العملية لكل عينة من عينات تركيزات الغادولينيوم المختلفة.

هذه أمثلة على أطياف مسجلة بلقطة واحدة من مناطق مختلفة من نسيج الكلية. سُجل الطيف الأزرق في المنطقة المركزية للكلية، بينما يمثل الطيف الأحمر غشاء الكلية، والطيف الأخضر للمنطقة المحيطية.

تتكون الجسيمات النانوية المحقونة والقائمة على الغادولينيوم من مصفوفة بوليس لآن (polys laane) مع أيونات غادولينيوم مخلبية بواسطة ربيطة doca على أسطحها. وفي النطاق الطيفي من 286 nanometer إلى 320 nanometer، يمكن الكشف عن الغادولينيوم والكالسيوم والحديد والسيليكون والألومنيوم. ويلاحظ كيف تتباين الشدة في المناطق المختلفة من العينة، مما يشير إلى عدم تجانس كبير في تركيزات هذه العناصر؛ وقد تم إجراء رسم خرائط نسيجية للغادولينيوم والسيليكون والحديد في شريحة من كلية فأر باستخدام بيانات LIBS بدقة تبلغ حوالي 100 micrometers.

يتم التعبير عن شدة المقياس بوحدة اعتبارية. هذه صورة بالضوء الطبيعي. وللمقارنة، تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام عينات من الأورام.

كما هو الحال في هذه الخريطة لأنسجة ورم gadolinium و SQ 20 B، تم وضع مقياس ألوان زائفة فوق الصورة الملتقطة بالضوء الطبيعي. في هذه التجربة، تم إعطاء الجسيمات النانوية مباشرة في الورم. وبعد مرور ساعة واحدة، تم استئصال الورم وتحضيره للتحليل.

لاحظ أن ما يقرب من نصف حجم الورم يحتوي على بعض الجسيمات. يمكن تنفيذ هذه التقنية في أقل من ساعة واحدة لعينات بمساحة سنتيمتر مربع واحد وبدقة تصل إلى 100 ميكرومتر إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. عند إجراء تحليل LIBS، من المهم تذكر أن القياسات تُؤخذ من البلازما الناجمة عن الليزر، ومن الضروري التحكم في جميع المعايير طوال التجربة وفقاً للإجراء المتبع.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية على مقاطع متجاورة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل نوع الخلايا المشاركة في العملية محل الاهتمام بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تقنية النانو المطبقة في البيولوجيا والطب لاستكشاف توزيع المركبات التي تحتوي على عناصر معدنية في الأنسجة البيولوجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استخدام تقنيات lips لرسم خرائط العناصر المتعددة في الأنسجة البيولوجية.