استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة التنميط الأيضي في الخلايا المستنبتة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج المستقلبات القطبية أولا من الخلايا. الخطوة الثانية هي إعادة تكوين مستخلصات الخلايا في الماء ونقل العينات إلى قوارير LC.

بعد ذلك ، يتم حقن العينات في أداة lc QE MS ، والتي تمت معايرتها وتسجيل البيانات الأولية في الكمبيوتر في الخطوة النهائية. يتم استخراج قمم المستقلب من البيانات الأولية باستخدام البرامج التجارية ، ويتم البحث عن قمم غير معروفة مقابل قاعدة بيانات جماعية عالية الدقة. على الرغم من أن هذا المعلم يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لمستويات المستقلب النسبية في السارس ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل المصل أو الأنسجة.

أولا ، قم بإعداد 500 مل من المرحلة المتنقلة A ، وهي 20 مللي مولار أسيتات الأمونيوم ، و 15 ملليمولار هيدروكسيد الأمونيوم في 3٪ أسيتو ونتريل والماء. بعد تغطية الزجاجة بشكل فضفاض ، قم بصوتنة المحلول في حمام مائي لمدة 10 دقائق دون تسخين. بعد ذلك ، قم بإذابة خمسة ملليغرامات من أسيتات فلورو الصوديوم ، والحمض في خمسة ملليلتر من الماء لتكوين تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل ملليلتر.

ثم قم بإذابة الديازينون في الميثانول لعمل تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام لكل مليلتر. لتحضير مليلتر واحد من محلول معايرة الكتلة المنخفضة السالبة ، امزج 960 ميكرولتر من محلول المعايرة الحرارية السالبة مع 20 ميكرولترا من أسيتات فلورو الصوديوم ومحلول حمض الهوموفانيليك. لصنع مليلتر واحد من محلول معايرة الكتلة المنخفضة الإيجابي ، امزج 990 ميكرولتر من محلول المعايرة الإيجابي الحراري و 10 ميكرولتر من محلول الديازينون.

بعد إجراء معايرة الكتلة القياسية في الوضع الموجب ، اضبط نطاق المسح الضوئي على نسبة 60 إلى 900 كتلة إلى شحن في لوحة التحكم في الجهاز وقم بتطبيق تفكك ناتج عن تصادم المصدر يبلغ 25 إلكترون فولت. أدخل أيونات المعايرة المخصصة ، وبمجرد استقرار مصدر الأيونات ، ابدأ المعايرة المخصصة في صفحة الضبط. قم بتبديل القطبية إلى الوضع السلبي بعد إجراء معايرة الكتلة القياسية في الوضع السلبي ، واضبط نطاق المسح الضوئي على نسبة الكتلة إلى الشحن من 60 إلى 900 في لوحة التحكم في الجهاز وقم بتطبيق تفكك ناتج عن تصادم المصدر يبلغ 35 إلكترون فولت.

أدخل أيونات المعايرة المخصصة ، وبمجرد استقرار مصدر الأيونات ، ابدأ المعايرة المخصصة. في صفحة الضبط ، قم بتجهيز أداة QE MS بتأين الرش الكهربائي الساخن أو مسبار HESI عن طريق تثبيته في المستوى C ثم توصيله بمداخل غاز النيتروجين وكابل المرذاذ وكابلات الجهد. في صفحة ضبط الكمبيوتر ، قم بتعيين معلمات الضبط ذات الصلة للمسبار.

اضبط درجة حرارة الشعيرات الدموية على 320 درجة مئوية والعدسة S على 55. بعد ذلك في برنامج الطريقة ، قم ببناء طريقة مسح كاملة باستخدام القيم التالية. قم بإنشاء طريقة الكروماتوغرافيا عن طريق إدخال معلومات التدرج الخطي.

استخدم عمودا متوسطا للفصل المركب في درجة حرارة الغرفة. في هذه المرحلة ، قم بإعداد مذيب استخلاص عن طريق خلط 40 مل من الميثانول و 10 ملليلتر من الماء يدويا في 50 ملليلترا. اثنان. عندما تم استزراعه سابقا سرطان القولون H CT تصل ثماني خلايا إلى 80٪ من التقاء.

استنشق الوسط بسرعة وضع صفيحة الآبار الستة فوق الثلج الجاف. ثم أضف على الفور ملليلتر واحد من مذيب الاستخراج إلى كل بئر وانقل اللوحة إلى فريزر سالب 80 درجة مئوية. بعد إخراج الطبق من الفريزر ، بعد 15 دقيقة ، ضعه فوق الثلج الجاف واكشط الخلايا في المذيب.

انقل المحلول من كل بئر إلى ثلاثة أنابيب einor سعة 1.7 مليلتر وقم بالطرد المركزي للعينات بسرعة 20،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوبين جديدين من einor. ثم جفف العينات في فراغ سريع.

بمجرد أن تجف العينات ، قم بتخزينها في الفريزر سالب 80 درجة مئوية. بعد إخراج العينات من الفريزر لتحليلها ، اتركها تصل إلى درجة حرارة الجليد. ثم أضف 20 ميكرولترا من الماء المثلج ، وقم بتدوير العينات لإذابة المستقلبات.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 20 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية. لمدة دقيقتين ، انقل SUPERNAT إلى قوارير lc وحقن خمسة ميكرولترات من العينات في أداة lc QES لتحليلها. بمجرد إجراء المعايرة بشكل صحيح على أداة QE MS ، قم بموازنة عمود lc لمدة خمس دقائق مع 85٪ من المرحلة B المتنقلة بمعدل تدفق يبلغ 0.15 مل في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد تسلسل العينة بترتيب عشوائي لتوزيع التقلبات التي أدخلها LCMS على كل عينة وضمان مقارنة أكثر دقة بين العينات المختلفة. بعد كل ست عينات، أضف عملية غسيل، متبوعة بعينة فارغة لتقييم خلفية النظام ومستويات الترحيل. احفظ التسلسل وابدأ تشغيل التسلسل.

بمجرد أن يظهر عمود lc ضغطا ثابتا قريبا من 400 رطل لكل بوصة مربعة ، بعد تشغيل أول عينتين من التسلسل ، تحقق من القمم في هذه الكروماتوغرامات بحثا عن مستقلبات غير معروفة للتأكد من أن تسلسل العينة يعمل بسلاسة. بعد الانتهاء من جميع العينات في التسلسل ، قم بإجراء تحليل البيانات على جهاز كمبيوتر منفصل. اختر طريقة محاذاة الذروة واستخراج الإطار للجزيء الصغير على البرامج المتاحة تجاريا.

ثم قم بتحميل البيانات الأولية lc ms وتجميعها بناء على أنواع العينات. اختر العينات في منتصف تسلسل التشغيل كعينة مرجعية للكروماتوغرافيا لمحاذاة الذروة، واختر مجموعة كمجموعة نسبة أو حساب التغيير الكامل. ثم قم بتحميل بذرة الإطار ، بما في ذلك المستقلبات المعروفة لتحليل المستقلب المستهدف مع البيانات التي تم جمعها وبذرة الإطار المقابلة.

بعد ذلك ، اختر فحص الأطياف الكامل إما في الوضع الإيجابي أو السلبي واحفظ ملف معالجة البيانات هذا في نفس المجلد مثل البيانات الأولية. قم بإيقاف تشغيل وظيفة البحث في قاعدة البيانات وتشغيل سير العمل. ثم قم بتصدير بيانات العملية كورقة Excel تحتوي على منطقة الذروة لكل إطار.

لتحليل المستقلب غير المستهدف ، اختر طريقة استخراج المكونات. قم بتحميل عينة البيانات الأولية وثلاث عينات فارغة لطرح الخلفية. بعد هذه المجموعة ، البيانات الأولية وتعيين العينات المرجعية كما هو موضح سابقا.

قم بتعيين عتبة المكون إلى 10 إلى الخامس. استخدم قاعدة بيانات التمثيل الغذائي البشري لتحديد المركب غير المعروف. بعد حفظ ملف المعالجة هذا، قم بإيقاف تشغيل وظيفة البحث في قاعدة البيانات وابدأ سير العمل.

بمجرد الانتهاء من معالجة البيانات ، استخدم معاملات التباين أو مرشحات السيرة الذاتية لإزالة المكونات ذات السيرة الذاتية الكبيرة داخل العينات المكررة ومرشحات الكثافة. لإزالة المكونات المكتشفة على مستوى الضوضاء، انتقل يدويا إلى كل مكون واختر تلك التي لها ذروة محددة جيدا أو اختلاف كبير نسبيا في أنواع العينات المختلفة للبحث في قاعدة البيانات. أخيرا ، قم بتصدير البيانات مع الزيارات في قاعدة البيانات.

تعتمد دقة بيانات التمثيل الغذائي بشكل كبير على أداء أداة lc QEMS لتقييم ما إذا كانت الأداة تعمل في حالة جيدة وما إذا كانت الطريقة المطبقة مناسبة. يتم استخراج العديد من قمم المستقلب lc المعروفة من الكروماتوغرافيا الأيونية الكلية كما هو موضح هنا. تتمتع المستقلبات القطبية بما في ذلك الأحماض الأمينية ، وتحلل السكر ، والوسيطة ، و TCA ، والنيوكليوتيدات الوسيطة ، والفيتامينات A TP و NADP ، باحتفاظ جيد بالعمود وأشكال الذروة الجيدة في ظل ظروف lc الحالية.

وفي الوقت نفسه ، يتم إجراء اختبار خطأ جماعي في غضون 24 ساعة بعد معايرة الكتلة المنخفضة كما هو موضح. هنا ، يتم تقييم خطأ الكتلة من خلال مقارنة نسبة الكتلة إلى الشحنة المكتشفة بنسبة الكتلة النظرية إلى الشحنة للمستقلبات المستهدفة. هنا ، تحتوي المستقلبات المستهدفة على نسبة كتلة إلى شحنة تتراوح من 74 إلى 744.

يمثل المحور Y هنا النسبة المئوية التراكمية للمستقلبات ضمن نطاق خطأ كتلي معين. يظهر المنحنى الأزرق النتيجة من صفر إلى 12 ساعة ، بينما يظهر المنحنى الأحمر البيانات التي تم جمعها من 12 إلى 24 ساعة بعد المعايرة. أكثر من 90٪ من المستقلبات تقع ضمن خمسة أجزاء في مليون خطأ كتلي ، مما يعني أن طريقة معايرة نطاق الكتلة المنخفضة التي تم تطويرها هنا كافية للحفاظ على خمسة أجزاء في المليون خطأ كتلي للكشف عن نطاق الكتلة المنخفض.

هناك مشكلة أخرى يجب معالجتها وهي حساسية الأداة مع الطريقة الحالية وإعداد الأداة. تم إجراء تخفيف تسلسلي لعينات ثلاثية من طبق بتري 10 سنتيمترات خمس مرات بعامل تخفيف ستة مما أدى إلى ستة تركيزات مختلفة من العينات. تستخدم قائمة مستهدفة لتقييم عدد المستقلبات المكتشفة بتركيزات مختلفة من العينة.

تشير النتائج الموضحة هنا إلى أن العدد الأمثل من المستقلبات المستهدفة المكتشفة يتراوح بين 2.78 في 10 إلى الخامس و 1.67 في 10 للخلايا الست ، بينما يعطي واحد في 10 إلى الخلايا السبع عددا أقل من المستقلبات المكتشفة ، ويرجع ذلك إلى تأثيرات قمع الأيونات. تشير هذه النتيجة إلى أن الكمية المثلى من الخلايا التي يجب استخراجها لهذا التحليل هي تقريبا تلك الموجودة في لوحة بستة آبار. لتحليل المستقلب غير المستهدف ، يتم استخدام قطع السيرة الذاتية بنسبة 20٪ ومتوسط قيمة الشدة من 10 إلى السابع لتصفية جدول المكونات.

يمكن زيادة قيم قطع السيرة الذاتية بينما يجب تقليل متوسط قيم الشدة لتشمل المزيد من القمم بعد التحقق يدويا من القمم ، يتم تحديد المكونات ذات الأشكال الجيدة والبحث عنها في قاعدة بيانات الأيض البشري. يتم سرد نتائج البيانات التي تم جمعها في الوضع الإيجابي هنا ، بينما يتم سرد نتائج الوضع السلبي هنا. تتداخل بعض المستقلبات المحددة هنا مع المستقلبات في القائمة المستهدفة ، مثل الجلوتاثيون والبرولين.

كما يتم استكشاف مستقلبات إضافية غائبة عن القائمة المستهدفة ، مثل ميثيل جليوكسال ، والتي يمكن اشتقاقها من تحلل السكر و pto واحد ، واثنين من ELE SN glycerol ، وثلاثة فوسفوكولين ، والتي يتم اكتشافها في الوضع الإيجابي مع وقت احتفاظ يبلغ 3.2 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج مستقلبات متعددة من السارس المستنبتة ثم استخدام RC QES لقياس مستويات الأيض النسبية في عينات مختلفة. شكرا لك على المشاهدة.