Juxtasomal Biocytin وصفها لدراسة بنية وظيفة علاقة فردية القشرية الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو ربط نشاط جهد الفعل النوعي لأنواع الخلايا في القشرة الحسية أثناء معالجة المعلومات بالهوية المورفولوجية للعصبونات المسجلة. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الجرذ جراحياً أولاً لإجراء التسجيلات المجاورة لجسم الخلية. وبمجرد التحضير، يقوم قطب كهربائي بتسجيل نشاط التدفق التلقائي والمستحث حسياً، ثم يتم تحميل العصبون المسجل بمادة biocidin باستخدام التيار والحقن.

بعد ذلك، يتم معالجة الدماغ لصبغ البيوتين. وفي النهاية، يتم إعادة بناء العصبون المملوء بالبيوتين رقمياً من المقاطع المتتالية لتصنيف نوع الخلية. وفي نهاية المطاف، تسمح التسجيلات المجاورة للسومات للعصبونات الفردية بدراسة المعالجة الحسية والمعلومات البنيوية داخل الشبكة القشرية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة محورية في علم الأعصاب، مثل ما هو دور أنواع الخلايا والطبقات الفردية أثناء المعالجة الحسية؟ وبشكل عام، يواجه الأشخاص الذين يحتاجون إلى هذه الطريقة صعوبة لأن قتل الخلايا العصبية أثناء عملية الملء أمر سهل للغاية. وتزداد فرص نجاح الملء باستخدام biocidin من خلال تحضير ماصات ذات جودة مثالية، بالإضافة إلى ضرورة وجود عين مدربة للتحكم في عمليات حقن التيارات ذات النطاق الضيق.

وبناءً على ذلك، يتطلب الأمر خبرة لزيادة معدل نجاح استعادة عصبونات ممتلئة جيداً. للبدء، ضع جرذ wistar مخدراً على إطار تثبيت مجسم (stereotaxic frame) مجهز بلوحة تدفئة. تحقق من عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس قرص إصبع القدم.

ثم أدخل مسباراً شرجياً للحفاظ على درجة حرارة الجسم الصحيحة. قم بتثبيت رأس الحيوان وإزالة الشعر من موقع الجراحة. ضع مرهماً على العينين لمنع الجفاف.

انتظر من ثلاث إلى خمس دقائق بعد حقن الليدوكائين في موقع العملية، ثم قم بإزالة الجلد الذي يغطي سطح الجمجمة. بعد ذلك، قم بإزالة أي أنسجة متبقية وتنظيف الجمجمة جيداً باستخدام محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9%. حدد إحداثيات القشرة الحسية الجسدية الأولية في نصف الكرة المخية الأيسر، وقم بتحديد الموقع على الجمجمة باستخدام قلم تحديد جراحي.

استخدم مثقاب الأسنان لكشط العظم من المنطقة المستهدفة. استمر في كشط العظم حتى يصبح شفافاً وتظهر الأوعية الدموية بوضوح. بعد ذلك، قم بعمل فتحة صغيرة في الجمجمة الرقيقة باستخدام المشرط.

مع الحرص على عدم إتلاف الأم الجافية والأوعية الدموية. حدد حواف عملية ثقب الجمجمة باستخدام قلم تحديد جراحي للجلد. ولتحسين الرؤية، ضع طبقة رقيقة من الصمغ السريع (super glue) على الجمجمة الجافة، ثم استخدم الإسمنت السني لإنشاء حوض.

عند إغلاق عملية فتح الجمجمة، قم بتقليم الشعيرات على الجانب المقابل لتكون بطول خمسة مليمترات بالضبط للمساعدة في رؤيتها. حدد الشعيرات المقلمة باستخدام ماسكارا سوداء قبل بدء التسجيلات، ثم قم بتصنيع ماصات الرقع (patch pipettes) من زجاج البوروسيليكات. الشكل المثالي للماصة هو تضيق تدريجي ونحيف، وزاوية مخروطية منخفضة، وقطر داخلي للطرف يبلغ حوالي 1 ميكرون.

املأ ماصة الرقعة (patch pipette) بمحلول رينجر الطبيعي للفئران (normal rad ringer)، المدعم بنسبة 2% من البيوتين (biotin)، ثم قم بتركيب ماصة الرقعة على حامل الماصات المثبت في مرحلة الرأس (head stage) والمتصل بمحرك مجهري (microm manipulator). لاستهداف العمود D2 في المنطقة S1 لدى الجرذ بشكل محدد، اضبط زاوية حامل القطب الكهربائي على 34 درجة بالنسبة للمستوى السهمي (sagittal plane). بعد ذلك، ضع ماصة الرقعة على مقربة من فتحة الجمجمة (craniotomy).

املأ الحوض بـ 0.9% sodium chloride. مع ضبط المضخم في وضع الجسر (bridge mode)، قم بتطبيق نبضات مربعة مع حقن تيار موجب لتحديد مقاومة القطب الكهربائي. تقع مقاومة القطب المثالية بين ثلاثة وخمسة ميجا أوم.

قم بتطبيق ضغط زائد يتراوح بين 100 إلى 150 millibar وقم بتمرير الماصة الرقيقة (patch pipette) بخطوات قدرها ميكرون واحد مع تطبيق تيار موجب على شكل نبضات مربعة. راقب التغير القوي في المقاومة عند حدوث التلامس مع الأم الجافية (dura mater). عند هذه النقطة، اضبط إحداثيات الميكرومناور (micro manipulator) على الصفر للسماح بقياسات دقيقة للعمق.

تقدم بوضع الخطوة الواحدة ميكرون حتى تخترق الماصة الرقعية الأم الجافية، وهو ما يشار إليه بانخفاض مفاجئ في مقاومة القطب. قم بإزالة ضغط التثبيت للماصة. بعد ذلك، ابحث عن وحدات مفردة أثناء التقدم بخطوات قدرها ميكرون واحد.

راقب مقاومة القطب الكهربائي باستمرار عن طريق تطبيق نبضات تشغيل وإيقاف مدتها 200 millisecond، حيث تشير الزيادة في مقاومة القطب عادةً إلى القرب من عصبون واحد؛ قم بتقديم القطب حتى يتم تسجيل موجات جهد فعل موجبة بجهد تقريبي قدره 2 millivolts. اختيارياً، قم بتسجيل نشاط التسنن التلقائي وتحديد نشاط التسنن الناجم عن تحريك الشوارب من خلال ثني الشوارب الفردية بشكل متقطع باستخدام جهاز بيزو-كهربائي، وذلك لتحقيق الظروف المثلى للملء بجوار الجسم الخلوي.

قم بتقديم القطب الكهربائي حتى تصبح المقاومة من 25 إلى 35 Mega ohms وتكون سعة النبضات من ثلاثة إلى ثمانية millivolts لبدء الملء المتاخم للسما. طبق نبضات تيار مربعة موجبة تبدأ من one nano amp.

قم بزيادة التيار ببطء وتدريجياً وبخطوات قدرها 0.1 nano amps مع مراقبة شكل موجة جهد الفعل (AP) وترددها. راقب انفتاح الغشاء من خلال الزيادة الواضحة في تردد جهد الفعل خلال مرحلة التشغيل (on phase) لنبضة الحجب؛ حيث يُظهر شكل موجة المسننة (spike) أثناء التعبئة زيادة في العرض وانخفاضاً في فرط الاستقطاب اللاحق. قم بزيادة أو تقليل التيار أثناء التعبئة للحفاظ على استقرار تدفق البيوتين، وقم بتقليل أو إيقاف نبضات التيار عند حدوث زيادة مفاجئة في تردد جهد الفعل، وذلك لتجنب السمية الناتجة عن التدفق المفرط للأيونات خارج الخلوية مثل أيونات الصوديوم.

من المهم ملاحظة أن كل عصبون سيستجيب بشكل مختلف لإجراء الملء. لذلك، يجب ضبط معايير الوسم بجوار جسم الخلية بناءً على حالة التسجيل. راقب الإشارة بدقة بعد إيقاف حقن التيار.

عادةً ما يكون شكل موجة السنبلة (spike) بعد جلسة الملء عريضاً ويظهر نقصاً شديداً في فرط الاستقطاب اللاحق؛ لذا يجب الانتظار حتى يتعافى العصبون، وهو ما يتضح عندما يعود شكل موجة السنبلة إلى خصائصه الأصلية لتقليل أي إجهاد ميكانيكي يلحق بالخلية. يتم سحب ماصة الرقعة (patch pipette) تدريجياً بمقدار ميكرون واحد في كل خطوة حتى تنخفض سعة السنبلة. يُنتظر لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للبيوتين بالانتشار داخل الخلايا مع المراقبة الدقيقة لدرجة حرارة جسم الحيوان وتنفسه. وأخيراً، يتم الحصول على عينات من الدماغ ومعالجتها للكشف عن جودة الوسم المتاخم للسومات (juxtasomal labeling).

تُظهر هذه الصور عصبونات مملوءة بطريقة الحقن الملاصق للسما (juxtasomally filled neurons) في القشرة الحسية الجسدية الأولية. ويُظهر هذا العرض المماسي لعصبون من المنطقة الجدارية الفرق في الحجم بين الزوائد الشجرية والمحاور. وفي هذا الإعادة البنائية الرقمية لعصبون مُعلم بطريقة الحقن الملاصق للسما، تظهر صورة إسقاط العصبون بدقة عالية ولكن بتكبير منخفض، مع تراكب إعادة البناء الرقمية الآلية حيث يظهر المحور باللون الأزرق والزوائد الشجرية باللون الأحمر على التوالي.

هنا تم توسيع منطقة المربع لإظهار أزرار المحوار على طول المحوار. في هذا الرسوم المتحركة النهائية، نوضح تسلسل عملية إعادة بناء عصبون من الخلايا ذات التويج السميك في الطبقة الخامسة من القشرة الحسية الجسدية الأولية للجرذ. يتضمن هذا التسلسل إعادة بناء المورفولوجيا الشجيرية والمحوارية بتكبير 100 مرة، وحدود البرميل بتكبير 4 مرات.

والنتيجة هي إعادة بناء ثلاثية الأبعاد كاملة، يتم تسجيلها لاحقاً ضمن إطار مرجعي موحد لإجراء تحليل كمي للخصائص المورفولوجية. وبذلك، يتيح الوسم الملاصق للسما (juxta somal labeling) في الجسم الحي جودة وسم استثنائية لإعادة بناء مورفولوجية ثلاثية الأبعاد كاملة وموثوقة. وقد استعرضنا هنا هذه الطريقة في حيوانات مخدرة باستخدام اليوريثان.

ومع ذلك، يمكن أيضاً استخدام تسجيلات Jux Somal في الحيوانات المستيقظة ذات الرؤوس المقيدة لدراسة دور أنواع الخلايا والطبقات الفردية أثناء الاستكشاف النشط للبيئة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية إجراء وسم Biocidin على الخلايا العصبية الفردية من أجل تحديد الهوية وإعادة البناء المورفولوجي بعد التجربة.