باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التموضع السطحي ومعدل الالتقام الخلوي لمستقبلات gabaa في عصبونات الحصين. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن عصبونات الحصين بالوحدة الفرعية لمستقبل gabaa الموصومة، وترك العصبونات المستزرعة لتنمو في الحاضنة. وتتمثل الخطوة الثانية في وسم مستقبلات gabaa السطحية باستخدام alpha bungalow toxin المقترن بصبغة Alexa الفلورية.

بعد ذلك، يتم تحضين العصبونات لفترات زمنية مختلفة للسماح بحدوث عملية الالتقام الخلوي للمستقبلات الموّسمة. وتتمثل الخطوة النهائية في تثبيت العينات في النقاط الزمنية المناسبة وإجراء صبغ مناعي باستخدام anti GFP لمراقبة إجمالي تجمع المستقبلات الموّسمة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر البؤري لإظهار التغيرات في التموضع السطحي والالتقام الخلوي لمستقبلات gabaa الموّسمة باستخدام مناهج التصوير الثابت أو الحي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعدنا في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال نقل المستقبلات، مثل التأثير الذي يمكن أن يحدثه ارتباط الربيطة على معدلات إدخال المستقبلات الخلوية وإقحامها، وما إذا كان بإمكان الربيطات والمعدِّلات المختلفة التأثير على إعادة تدوير المستقبلات وتحللها. وعلى الرغم من استخدام هذه الطريقة لدراسة القنوات الأيونية المرتبطة بربيطة والمستقبلات المقترنة بالبروتين G بشكل أساسي في سياق الجهاز العصبي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لدراسة التموضع الديناميكي ونقل بروتينات غشائية أخرى في المزارع الخلوية والخلايا الأولية من أنسجة متنوعة. وبوجه عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبات لسببين.

أولاً، لإنشاء بنيات وظيفية، وثانياً، اكتساب الممارسة والخبرات اللازمة لمعالجة نقاط زمنية متعددة في وقت واحد. للبدء، قم بتحضير أربع إلى خمس شرائح غطاء زجاجية دائرية مطلية بـ poly de lysine داخل كل طبق زراعة أنسجة بحجم 3.5 centimeter كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بنقل one to four micrograms من DNA البنية المحضر بطريقة maxi prepped إلى عصبونات مفصولة حديثاً في يوم الزراعة.

تُنقل الخلايا العصبية التي تم نقل الجينات إليها إلى شرائح غطاء مطلية بـ poly de lycine بكثافة نهائية تبلغ حوالي 200, 000 خلية عصبية لكل طبق بمقاس 3.5 centimeter. يتم استبدال الوسط الغذائي بعد مرور 4 إلى 24 ساعة من تحضير المزارع العصبية. ثم تُترك الخلايا العصبية لتنمو في الحاضنة حتى مرور 14 إلى 17 يوماً in vitro أو الوصول إلى المرحلة المطلوبة لإجراء مقايسة الالتقام الخلوي.

أولاً، اضبط جهاز التبريد والتسخين المكتبي على 16 درجة مئوية. قم بتبريد محلول HBS (المحلول الملحي المنظم للـ heaps خارج الخلية) إلى 16 درجة مئوية في حمام مائي. انقل أطباق العصبونات إلى اللوح الألمنيوم عند 16 درجة مئوية واتركها لتبرد لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الوسط واستبداله بـ 1 mL من HBS بدرجة حرارة 16 °C مضافاً إليه 150 µM من two Bo Rine لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بنقل الوسط إلى حاوية نفايات مُعلمة واستبدله بـ 1 mL من HBS بدرجة حرارة 16 °C مضافاً إليه two bo kerine و alpha bungalow toxin Alexa 5 9 4، مع التحضين عند درجة حرارة 16 °C لمدة 15 دقيقة.

بعد التحضين، انقل الوسط إلى حاوية نفايات مُعلمة واغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام 2 mL من HBS بدرجة حرارة 16 °C لإجراء تجارب التصوير الحي المتسلسل بعد عملية إدخال المستقبلات الخلوية (receptor endocytosis) باستخدام طبق زراعة بقطر 3.5 cm وقاعدة زجاجية. انقل الطبق إلى منصة مسخنة على المجهر وابدأ التصوير باستخدام مجهر بؤري (confocal) أو مجهر turf. قم بالإعداد لشرائح التغطية المثبتة.

انقل شرائح التغطية الخاصة بالنقطة الزمنية T equals zero إلى طبق يحتوي على 4%para formaldehyde و 4%sucrose في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة بالنسبة للنقاط الزمنية الأخرى. استبدل HBS بوسط غذائي متوازن ومكيف عند 37 degrees Celsius، وأعدها إلى الحاضنة لإتمام عملية الالتقام الخلوي عند 37 degrees Celsius في النقاط الزمنية المطلوبة. أخرج الأطباق من الحاضنة واغسلها سريعاً مرتين باستخدام 2 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (DPBS) في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتثبيت العينة في 4%paraform aldehyde و 4%sucrose لمدة 20 دقيقة. وبعد انتهاء عملية التثبيت التي استغرقت 20 دقيقة، تخلص من 4%paraform aldehyde و 4%sucrose في حاوية النفايات، واغسل الأطباق مرتين باستخدام 2 mL من DPBS بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتحضين شرائح التغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

محلول حجب للفحص المناعي الفلوري يحتوي على 0.2% Triton X 100 لنفاذية العصبونات وتمكين الصبغ المناعي لـ anti GFP لمجموعة المستقبلات داخل الخلوية و/أو وسم البروتينات الأخرى ذات الصلة. ثم يتم إزالة محلول الحجب النفاذي وتحضين الشرائح الغطائية في محلول حجب للفحص المناعي الفلوري بدون Triton X 100 لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. يتم إجراء تحضين الأجسام المضادة الأولية للشرائح الغطائية في محلول الحجب لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 degrees Celsius بعد عملية التحضين.

اغسل شرائح التغطية عن طريق نقعها في DPBS لمدة خمس دقائق لثلاث مرات إجمالاً. بعد ذلك، قم بتحضين شرائح التغطية مع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد مرور ساعة واحدة. اغسل شرائح التغطية ثلاث مرات باستخدام DPBS كما سبق.

بعد ذلك، قم بتثبيت كل شريحة غطاء عن طريق إزالة السائل الزائد من ظهر شريحة الغطاء باستخدام منديل مختبري، ثم اقلب شريحة الغطاء فوق 4 µL من وسط التثبيت على شريحة زجاجية. قم بعملية الحصول على الصور باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) دون معرفة الحالة التجريبية، وذلك باستخدام عدسة غمر زيتية بقوة تكبير 60 x وفتحة عددية 1.49.

باستخدام نفس إعدادات التقاط الصور، يتم التقاط صور لمقطع Z واحد بحيث يكون جسم الخلية العصبية والعديد من الزوائد الشجيرية في بؤرة التركيز، ثم يتم قياس إشارة alpha bungalow toxin الفلورية من Alexa وصبغة GFP المناعية على طول 20 microns من ثلاث إلى أربع زوائد شجيرية قريبة لكل عصبون، مع استخدام نفس العتبة لتحليل جميع بيانات الالتقام الخلوي. يتم تحليل البيانات من 10 إلى 12 عصبوناً لكل نقطة زمنية، مع تكرار التجربة باستخدام عدة مزارع عصبونية مستقلة.

تُشكل المحاوير العصبية من النوع GABAergic اتصالات تثبيطية على استطالات الشجيرات العصبية للخلايا العصبية الهرمية. ويتم تحديد النهايات التثبيطية قبل المشبكية بواسطة ناقل الأحماض الأمينية التثبيطية الحويصلي الذي يقوم بتحميل GABA و glycine في الحويصلات المشبكية. وتقابل مستقبلات GABA a بشكل وثيق مواقع إطلاق النواقل العصبية المرتبطة ببروتين gein، وهو بروتين السقالة التثبيطي بعد المشبكي الموضح هنا؛ تظهر في الصورة خلايا عصبية تعبر عن alpha two phg F-P-B-B-S مع وسم مستقبلات gabaa السطحية باستخدام سم bungalow Alexa 5 9 4، يليه صبغ مناعي لمجمل مجتمع المستقبلات باستخدام جسم مضاد anti GFP الموضح باللون الأخضر، وإما بروتين السقالة التثبيطي بعد المشبكي gein أو ناقل الأحماض الأمينية التثبيطية الحويصلي.

يظهر هنا عملية الالتقام الخلوي لمستقبل GABA A الذي يحتوي على alpha two في عصبونات الحصين بعد 15 يوماً في المختبر باستخدام alpha bungalow toxin. تم تطبيع قياسات الفلورية للزوائد الشجيرية الفردية الموضحة في اللوحات وفقاً لمستوى تعبير البناء من خلال أجسام GFP المضادة. تم إجراء المقارنة النهائية بين النقاط الزمنية عن طريق التطبيع بالنسبة لقياس T equals zero.

وُصف التقدير الكمي لعملية استدخال المستقبلات على مدار فترة زمنية مدتها 60 دقيقة، من خلال تغيرات الإشارة الفلورية بمرور الوقت، بشكل أفضل بواسطة دالة أسية واحدة. وهناك نهج بديل يتمثل في تتبع عملية إدخال المستقبلات في عصبون واحد عن طريق التصوير الحي المتقطع باستخدام المجهر البؤري. وتظهر الفلورة النقطية والمتداخلة لمستقبل GABA A المسمى بـ P-H-G-F-P والمستقبلات المسمى بـ alpha bungalow toxin السطحية في بداية التجربة؛ ومع مرور الوقت، تتناقص إشارة مستقبل GABA A المسمى بـ alpha bungalow toxin مع حدوث عملية استدخال المستقبلات.

بينما تظل إشارة P-H-G-F-P مرتفعة نتيجة لإدراج مستقبلات جديدة، فإن الانخفاض الطفيف في إشارة P-H-G-F-P يعود إلى تغيرات في توزيع المستقبلات على سطح الخلية وإلى التبييض الضوئي عقب هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل مقاييس إدراج سم البنغالا (bungalow toxin)، للإجابة على أسئلة إضافية مثل معدلات إدراج المستقبلات مع معالجات مختلفة. تتيح هذه التقنية تقييم كيفية قيام النشاط الخلوي، ونطاقات بروتينية محددة، والمحفزات، والمعدلات الأخرى بتعديل معدل دوران المستقبلات في العصبونات الحية، والخلايا والأنسجة الأخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام سم alpha bungalow المقترن بأصباغ Alexa بالتزامن مع تقنيات التألق المناعي القياسية لتحديد كمية تموضع المستقبلات السطحية في عصبونات الحصين.