باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس توطين سطح مستقبلات gabaa والالتقام الخلوي في الخلايا العصبية في الحصين. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا العصبية الحصين أولا مع الوحدة الفرعية لمستقبلات gabaa الموسومة والسماح للخلايا العصبية المستنبتة بالتطور في الحاضنة. الخطوة الثانية هي تسمية مستقبلات gabaa السطحية ب alpha bungalow toin مقترن ب Alexa الفلوري.

بعد ذلك ، يتم احتضان الخلايا العصبية لنقاط زمنية مختلفة للسماح للمستقبلات المسماة بأن تكون خلوية. الخطوة الأخيرة هي إصلاح العينات في النقاط الزمنية المناسبة وإجراء تلطيخ مناعي باستخدام مضاد GFP لمراقبة إجمالي مجموعة المستقبلات الموسومة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لإظهار التغييرات في توطين السطح والالتقام الخلوي لمستقبلات الجبا الموسومة باستخدام مناهج التصوير الثابت أو الحي.

يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاتجار بالمستقبلات ، مثل التأثير الذي يمكن أن يحدثه ارتباط الترابط على الالتقام الخلوي للمستقبلات ومعدلات الإدخال، وما إذا كانت الروابط والمغيرات المختلفة يمكن أن تؤثر على إعادة تدوير المستقبلات وتدهورها. على الرغم من أن هذه الطريقة قد استخدمت لدراسة القنوات الأيونية المربوطة ومستقبلات مقترنة ببروتين G بشكل أساسي في سياق الجهاز العصبي ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها لدراسة التوطين الديناميكي والاتجار ببروتينات الغشاء الأخرى في زراعة الخلايا والخلايا الأولية للأنسجة المتنوعة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لسببين.

أولا ، لإنشاء التركيبات الوظيفية وثانيا الممارسة والخبرات اللازمة لمعالجة عدة نقاط زمنية في وقت واحد. للبدء ، قم بإعداد أربعة إلى خمسة زلات مستديرة من الغطاء الزجاجي المطلي بالبولي دي ليسين داخل كل طبق زراعة أنسجة بطول 3.5 سم كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم قم بنقل الخلايا العصبية المنفصلة حديثا في يوم الاستزراع باستخدام واحد إلى أربعة ميكروغرام من لوحة الحمض النووي المعدة للماكسي.

تنزلق الخلايا العصبية المنقولة على الغطاء المطلي ببولي دي ليسين بكثافة نهائية تبلغ حوالي 200،000 خلية عصبية لكل طبق 3.5 سم. استبدل الوسط بعد أربع إلى 24 ساعة من تحضير المزارع العصبية. ثم اسمح للخلايا العصبية بالتطور في الحاضنة حتى 14 إلى 17 يوما في المختبر أو المرحلة المرغوبة لإجراء فحص الالتقام الخلوي.

قم أولا بضبط جهاز تسخين التبريد على المنضدة على 16 درجة مئوية. قم بتبريد أكوام خارج الخلية أو محلول ملحي مخزن أو HBS إلى 16 درجة مئوية في حمام مائي. انقل أطباق الخلايا العصبية إلى صفيحة الألمنيوم عند 16 درجة مئوية وتبرد لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الوسط واستبدله بملليلتر واحد من 16 درجة مئوية HBS بالإضافة إلى 150 ميكرومولار اثنين من Bo Rine لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط إلى حاوية نفايات مصنفة واستبدله بمليلتر واحد من 16 درجة مئوية HBS بالإضافة إلى اثنين من بو كيرين بالإضافة إلى سم بنغل ألفا. Alexa 5 9 4 تحتضن عند 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، انقل الوسط إلى حاوية نفايات مصنفة واغسل الأطباق ثلاث مرات بملليلترين من 16 درجة مئوية HBS لتجارب السلسلة الزمنية للتصوير الحي بعد الالتقام الخلوي للمستقبلات باستخدام طبق استزراع زجاجي بحجم 3.5 سم. انقل الطبق إلى مرحلة ساخنة على المجهر وابدأ التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر أو العشب. قم بالإعداد لزلات الغطاء الثابتة.

نقل T يساوي غطاء نقطة زمنية صفرية ينزلق في طبق بدرجة حرارة الغرفة 4٪ بارا فورمالديهايد ، 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة للنقاط الزمنية الأخرى. استبدل HBS بوسط مكيف مشروط 37 درجة مئوية ، والعودة إلى الحاضنة للالتقام الخلوي عند 37 درجة مئوية في النقاط الزمنية المطلوبة. خذ الأطباق من الحاضنة واغسلها بسرعة مرتين باستخدام ملليلترين من درجة حرارة الغرفة أو فوسفات ديلكوس أو محلول ملحي مخزن أو DPBS.

ثم قم بإصلاح العينة في 4٪ ألدهيد بارافورم ، 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة. بعد تثبيت لمدة 20 دقيقة ، قم بإزالة 4٪ ألدهيد بارافورم ، 4٪ سكروز إلى حاوية النفايات ، واغسل الأطباق مرتين باستخدام ملليلترين من DPBS بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن زلات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

محلول كتلة التألق المناعي يحتوي على 0.2٪ Triton X 100 لاختراق الخلايا العصبية وتمكين التلوين المناعي المضاد ل GFP لمجموعة المستقبلات داخل الخلايا و / أو وضع العلامات على البروتينات الأخرى ذات الأهمية. ثم قم بإزالة محلول الكتلة النفاذة واحتضان زلات الغطاء في محلول كتلة التألق المناعي بدون Triton X 100 لمدة 20 إلى 30 دقيقة. إجراء حضانات أولية للأجسام المضادة لزلات الغطاء في كتلة لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية بعد الحضانة.

اغسل زلات الغطاء عن طريق النقع في DPBS لمدة خمس دقائق ليصبح المجموع ثلاث غسلات. ثم احتضان زلات الغطاء مع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الكتلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد ساعة واحدة. اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام DPBS كما كان من قبل.

بعد ذلك ، قم بتركيب كل زلة غطاء عن طريق إزالة السائل الزائد من الجزء الخلفي من زلة الغطاء بأنسجة المختبر ثم عكس زلة الغطاء على أربعة ميكرولترات من وسط التثبيت على شريحة زجاجية. قم بإجراء الحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر الأعمى للحالة التجريبية باستخدام فتحة رقمية للزيت 60 ×. 1.49 هدف الغمر.

باستخدام نفس إعدادات الحصول على الصور ، احصل على صور قسم Z مفردة مع جسم الخلية العصبية والعديد من العمليات التغصنية في التركيز على تحديد سم بنغل ألفا وإشارة أليكسا الفلورية وتلوين مناعي GFP على طول 20 ميكرون من ثلاثة إلى أربعة تشعبات قريبة لكل خلية عصبية باستخدام نفس العتبة لتحليل جميع بيانات الالتقام الخلوي. تحليل البيانات من 10 إلى 12 خلية عصبية لكل نقطة زمنية. تكرار التجربة مع العديد من الثقافات العصبية المستقلة.

المحاور GABAergic جعل اتصالات مثبطة على التشعبات العصبية الهرمية. يتم تحديد المحطات المثبطة قبل التشابك بواسطة ناقل الأحماض الأمينية المثبط الحويصلي الذي يحمل GABA والجلايسين في الحويصلات المتشابكة. تتعارض مستقبلات GABA a بشكل وثيق مع مواقع إطلاق الناقل العصبي المربوطة بسقالة ما بعد التشابك المثبطة بروتين gein الموضحة هنا هي alpha two phg F-P-B-B-S التي تعبر عن الخلايا العصبية مع مستقبلات gabaa السطحية المسماة بسم البنغل Alexa 5 9 4 متبوعا بالتلوين المناعي لإجمالي المستقبلات مع الجسم المضاد المضاد ل GFP الموضح باللون الأخضر ، وإما بروتين السقالة المثبط بعد التشابك أو ناقل الأحماض الأمينية المثبط الحويصلي.

هنا يظهر الالتقام الخلوي لألفا اثنين الذي يحتوي على مستقبلات GABA A والخلايا العصبية الحصين في 15 يوما في المختبر سم ألفا بنغل. التألق يتم تطبيع قياسات العمليات المتغصنة الفردية كما هو موضح في اللوحات إلى مستوى التعبير عن البناء عبر الأجسام المضادة GFP. يتم إجراء المقارنة النهائية للنقاط الزمنية عن طريق التطبيع إلى T يساوي القياس صفرا.

أفضل وصف لاستيعاب المستقبلات على مدى 60 دقيقة من تغيرات إشارة الفلورسنت بمرور الوقت هو أفضل وصف من خلال أسي واحد. النهج البديل هو اتباع الالتقام الخلوي الداخلي للمستقبلات في خلية عصبية واحدة عن طريق التصوير المباشر للفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني. التألق المنقط والمتداخل لمستقبلات P-H-G-F-P الموسومة ب GABA A ومستقبلات السم السطحي ألفا بنغل مرئية في بداية التجربة على مر الزمن ، تنخفض إشارة مستقبلات ألفا بنغل المسماة GABA A مع وجود الخلايا الداخلية للمستقبلات.

في حين أن إشارة P-H-G-F-P تظل عالية بسبب إدخال مستقبلات جديدة ، فإن الانخفاض الضئيل في إشارة P-H-G-F-P يرجع إلى تغيرات توزيع مستقبلات سطح الخلية والتبييض الضوئي باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات إدخال السموم في البنغل للإجابة على أسئلة إضافية مثل معدلات إدخال المستقبلات مع علاجات مختلفة. تسمح هذه التقنية للمرء بتقييم كيف يمكن للنشاط الخلوي ومجالات البروتين المحددة وناهضات والمغيرات الأخرى تعديل دوران المستقبلات في الخلايا العصبية الحية والخلايا والأنسجة الأخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام أصباغ Alexa المقترنة بسم ألفا بنغل بالاشتراك مع تقنيات الفلورسنت المناعي القياسية لتحديد توطين المستقبلات السطحية في الخلايا العصبية في الحصين.