إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة
January 2nd, 2014
إن ربط الف virions بالسطح هو شرط لتصوير الفيروسة الواحدة عن طريق التصوير الفلوري فائق الدقة أو المجهر للقوة الذرية (AFM). هنا نحن نثبت طريقة إعداد عينة للالتصاق الخاضعة للرقابة من virions إلى الأسطح الزجاجية مناسبة للاستخدام في AFM والتصوير الفلوري فائقة الدقة.
يقوم هذا الإجراء بإعداد زلات الغطاء الزجاجي مع الفيروسات لاستخدامها في الفحص المجهري للقوة الذرية والفحص المجهري فائق الدقة ، مثل الفحص المجهري للتوطين المنشط بالصور الفلورية. أولا ، قم بتنظيف الركيزة الزجاجية ، وقم بتغطية الزجاج بغشاء رقيق من البولي إيثيلين جلايكول الحيوي جزئيا المطعمة ببولي L lysine. بعد ذلك ، عالج السطح باستخدام أفادون لزيادة تقارب ربط الفيلم الحيوي.
الآن عالج السطح بالأجسام المضادة الحيوية الخاصة بالفيروس المعني. ثم عالج السطح المحضر للجسم المضاد بالفيروس المعني. على عكس طلاء الدوران ، تتميز هذه التقنية بتوزيع المتغيرات على طول السطح بشكل متجانس.
من أجل تحسين الفحص المجهري ، ضع الغطاء عموديا في رف انزلاق غطاء تفلون بحجم مناسب ، واغمرها في دورق مملوء بسونيكات الكحول الإيثيلي المصفى لمدة 30 دقيقة. ثم اشطف الغطاء على نطاق واسع بالماء النقي للغاية. بعد ذلك ، ضع الغطاء في رف تفلون نظيف منفصل ودورق مملوء بصوت هيدروكسيد الصوديوم المولي لمدة 30 دقيقة واشطفه على نطاق واسع بالماء عالي النقاء.
الآن جفف زلات الغطاء المغسول تحت تيار النيتروجين وانقلها إلى رف تفلون جاف ونظيف. تحقق من أن كل زلة غطاء نظيفة من أي غشاء أو جزيئات مرئية. مباشرة بعد التجفيف في تيار النيتروجين أفقيا ، ضع غطاء واحد في طبق بتري معقم في وسط ماصة انزلاق الغطاء الكمية المناسبة من البولي إيثيلين جلايكول المطعمة بالبولي إيثيلين المطعمة بالبيوتينيل في PBS.
ضع غطاء نظيف آخر فوق السائل بطريقة شطيرة. تأكد من أن الحجم بين الوجوه النشطة لزلاقتي الغطاء مملوءة بالكامل بالسوائل. غطي طبق بتري واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة.
بعد ذلك ، التقط الساندويتش بزوج من الملقط دون قرص السوائل الزائدة. الآن باستخدام الإبهام والسبابة ، اضغط على الساندويتش برفق وأفقيا. حرك الغطاء في اتجاهين متعاكسين وافصلهما دون لمس الوجوه النشطة.
اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من الماء النقي للغاية. الآن جفف زلات الغطاء بتيار نيتروجين ولاحظ الغطاء الذي تنشط في طبق بتري معقم. ضع زلة غطاء معالجة مع الماصة النشطة ذات الوجه النشط لأعلى بكمية مناسبة من محلول الأدلة المذاب في منتصف الوجه النشط.
ضع زلة غطاء أخرى مع وجهها النشط لأسفل لشطيرة السائل ، ثم احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، افصل بين زلات الغطاء كما هو موضح سابقا. تأكد من عدم لمس الوجوه النشطة.
الآن اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من الماء النقي للغاية ثم جفف زلات الغطاء بتيار النيتروجين. من المهم أن تتذكر وجوه انزلاق الغطاء النشطة. للرجوع إليها في المستقبل ، ضع على الفور غطاء نشطا متعطشا ومعالجا ووجهه لأعلى في طبق بتري معقم ، وقم بسحب كمية مناسبة من الجسم المضاد الحيوي الذوبان في منتصف الوجه النشط.
ضع زلة غطاء أخرى مع وجهها النشط لأسفل فوق السائل بطريقة الساندويتش. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة بعد فصل زلات الغطاء ، اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من PBS. ثم ضع زلة غطاء معالجة بالأجسام المضادة مع وجهها النشط لأعلى في طبق بتري معقم وماصة كمية مناسبة من الفيروس في منتصف الوجه النشط.
الآن شطيرة بغطاء نشط ثان ، انزلق ، غطي ، واحتضن. الآن افصل بين زلات الغطاء. اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من PBS وانقلهما إلى رف تفلون ودورق مملوء ب PBS.
استخدم العينات المحضرة على الفور على الفور أو قم بتخزينها على أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. هنا. تم تثبيت التباين البري من فيروس التهاب الفم الحويصلي على السطح الزجاجي وتحليله بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية. يبلغ عرض وطول الفيروس 80 نانومتر × 180 نانومتر ، مما يظهر الحد الأدنى من التشوهات عن الحجم الأصلي للفيريون.
في هذه التجربة ، تم تصوير الفيروس الفردي بواسطة الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري. باستخدام Alexis 6 47 الأجسام المضادة VSVG المسماة. يوضح السطح المتساوي الأزرق السطح المستعاد للفيريون باستخدام الفحص المجهري FOM.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير زلات الغطاء الزجاجي مع الفيروسات لاستخدامها مع الفحص المجهري للقوة الذرية أو الفحص المجهري فائق الدقة. من المهم أن تتذكر في جميع الأوقات وجه زلة الغطاء الذي يحتوي على الكيمياء النشطة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحضير شرائح زجاجية مغطاة بالفيروسات لاستخدامها في مجهر القوة الذرية (AFM) وتصوير الفلوريسنس فائق الدقة. تضمن هذه التقنية التصاقًا متحكمًا به للفيروسات، مما يسهل تصوير الهياكل الفيروسية بدقة عالية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- تقنيات التصوير المجهري
الخلفية
- التصاق الفيروسات ضروري لتقنيات التصوير مثل AFM ومجهر فائق الدقة.
- التصاق المتحكم به يحسن جودة نتائج التصوير.
- قد لا توفر الطرق السابقة توزيعًا موحدًا للفيروسات.
- تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لتحضير العينات.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لتصاق الفيروسات بالأسطح الزجاجية.
- تحسين جودة التصوير في مجهر القوة الذرية ومجهر فائق الدقة.
- إظهار فعالية الطريقة باستخدام فيروس التهاب الفم الحويصلي.
الطرق المستخدمة
- تنظيف وتغطية الشرائح الزجاجية باستخدام البولي إيثيلين جلايكول المرتبط بالبيوتين.
- معالجة الأسطح باستخدام الأفيدين والأجسام المضادة المرتبط بالبيوتين والمحددة للفيروس.
- وضع الشرائح بين قطعتين لتسهيل توزيع السائل بشكل موحد.
- استخدام تقنيات الصوتنة والشطف لضمان النظافة.
النتائج الرئيسية
- تم إرساء الفيروسات بنجاح على الأسطح الزجاجية للتصوير.
- تم تصوير الفيروسات الفردية بحد أدنى من التشوه باستخدام التصوير الفلوري.
- أظهرت الطريقة توزيعًا فعالًا للفيروسات عبر السطح.
- أكدت النتائج جدوى طريقة التحضير للتصوير فائق الدقة.
الخلاصات
- توفر الطريقة المطورة نهجًا موثوقًا لتصاق الفيروسات.
- تعزز هذه التقنية جودة التصوير في تطبيقات المجهر.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه الطريقة لمختلف تطبيقات التصوير الفيروسي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
