إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

يقوم هذا الإجراء بإعداد زلات الغطاء الزجاجي مع الفيروسات لاستخدامها في الفحص المجهري للقوة الذرية والفحص المجهري فائق الدقة ، مثل الفحص المجهري للتوطين المنشط بالصور الفلورية. أولا ، قم بتنظيف الركيزة الزجاجية ، وقم بتغطية الزجاج بغشاء رقيق من البولي إيثيلين جلايكول الحيوي جزئيا المطعمة ببولي L lysine. بعد ذلك ، عالج السطح باستخدام أفادون لزيادة تقارب ربط الفيلم الحيوي.

الآن عالج السطح بالأجسام المضادة الحيوية الخاصة بالفيروس المعني. ثم عالج السطح المحضر للجسم المضاد بالفيروس المعني. على عكس طلاء الدوران ، تتميز هذه التقنية بتوزيع المتغيرات على طول السطح بشكل متجانس.

من أجل تحسين الفحص المجهري ، ضع الغطاء عموديا في رف انزلاق غطاء تفلون بحجم مناسب ، واغمرها في دورق مملوء بسونيكات الكحول الإيثيلي المصفى لمدة 30 دقيقة. ثم اشطف الغطاء على نطاق واسع بالماء النقي للغاية. بعد ذلك ، ضع الغطاء في رف تفلون نظيف منفصل ودورق مملوء بصوت هيدروكسيد الصوديوم المولي لمدة 30 دقيقة واشطفه على نطاق واسع بالماء عالي النقاء.

الآن جفف زلات الغطاء المغسول تحت تيار النيتروجين وانقلها إلى رف تفلون جاف ونظيف. تحقق من أن كل زلة غطاء نظيفة من أي غشاء أو جزيئات مرئية. مباشرة بعد التجفيف في تيار النيتروجين أفقيا ، ضع غطاء واحد في طبق بتري معقم في وسط ماصة انزلاق الغطاء الكمية المناسبة من البولي إيثيلين جلايكول المطعمة بالبولي إيثيلين المطعمة بالبيوتينيل في PBS.

ضع غطاء نظيف آخر فوق السائل بطريقة شطيرة. تأكد من أن الحجم بين الوجوه النشطة لزلاقتي الغطاء مملوءة بالكامل بالسوائل. غطي طبق بتري واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة.

بعد ذلك ، التقط الساندويتش بزوج من الملقط دون قرص السوائل الزائدة. الآن باستخدام الإبهام والسبابة ، اضغط على الساندويتش برفق وأفقيا. حرك الغطاء في اتجاهين متعاكسين وافصلهما دون لمس الوجوه النشطة.

اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من الماء النقي للغاية. الآن جفف زلات الغطاء بتيار نيتروجين ولاحظ الغطاء الذي تنشط في طبق بتري معقم. ضع زلة غطاء معالجة مع الماصة النشطة ذات الوجه النشط لأعلى بكمية مناسبة من محلول الأدلة المذاب في منتصف الوجه النشط.

ضع زلة غطاء أخرى مع وجهها النشط لأسفل لشطيرة السائل ، ثم احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، افصل بين زلات الغطاء كما هو موضح سابقا. تأكد من عدم لمس الوجوه النشطة.

الآن اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من الماء النقي للغاية ثم جفف زلات الغطاء بتيار النيتروجين. من المهم أن تتذكر وجوه انزلاق الغطاء النشطة. للرجوع إليها في المستقبل ، ضع على الفور غطاء نشطا متعطشا ومعالجا ووجهه لأعلى في طبق بتري معقم ، وقم بسحب كمية مناسبة من الجسم المضاد الحيوي الذوبان في منتصف الوجه النشط.

ضع زلة غطاء أخرى مع وجهها النشط لأسفل فوق السائل بطريقة الساندويتش. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة بعد فصل زلات الغطاء ، اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من PBS. ثم ضع زلة غطاء معالجة بالأجسام المضادة مع وجهها النشط لأعلى في طبق بتري معقم وماصة كمية مناسبة من الفيروس في منتصف الوجه النشط.

الآن شطيرة بغطاء نشط ثان ، انزلق ، غطي ، واحتضن. الآن افصل بين زلات الغطاء. اشطف كلا الوجهين النشطين ب 25 مل من PBS وانقلهما إلى رف تفلون ودورق مملوء ب PBS.

استخدم العينات المحضرة على الفور على الفور أو قم بتخزينها على أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. هنا. تم تثبيت التباين البري من فيروس التهاب الفم الحويصلي على السطح الزجاجي وتحليله بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية. يبلغ عرض وطول الفيروس 80 نانومتر × 180 نانومتر ، مما يظهر الحد الأدنى من التشوهات عن الحجم الأصلي للفيريون.

في هذه التجربة ، تم تصوير الفيروس الفردي بواسطة الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري. باستخدام Alexis 6 47 الأجسام المضادة VSVG المسماة. يوضح السطح المتساوي الأزرق السطح المستعاد للفيريون باستخدام الفحص المجهري FOM.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير زلات الغطاء الزجاجي مع الفيروسات لاستخدامها مع الفحص المجهري للقوة الذرية أو الفحص المجهري فائق الدقة. من المهم أن تتذكر في جميع الأوقات وجه زلة الغطاء الذي يحتوي على الكيمياء النشطة.