طرق لتسهيل النمو الميكروبي على اللب مطحنة النفايات تيارات وتوصيف إمكانات التحلل الحيوي من الميكروبات مثقف

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد قدرة الكائنات الحية الدقيقة أو اتحادات الكائنات الحية الدقيقة على استخدام نفايات اللب الخمور السوداء للنمو ، ومكونات الخمور السوداء التي يتم استخدامها للنمو والمنتجات التي ينتجها التمثيل الغذائي الميكروبي لنفايات اللب هذه. يتم تحقيق ذلك من خلال جمع نفايات اللب الخمور السوداء وإعدادها لاستخدامها كمكون وسط للاستزراع. كخطوة ثانية ، يتم استخراج مكونات اللجنوسليلوز ، والتي تستخدم لتحديد متطلبات مصدر الكربون للكائنات الحية الدقيقة.

يتم تحضير الوسائط التالية وتلقيحها وتحليلها للنمو الميكروبي من أجل تحديد قدرة الكائنات الحية الدقيقة على النمو على الخمور السوداء ومكوناتها. تظهر النتائج استخدام الخمور السوداء كمصدر وحيد للكربون لنمو وتوليف المنتجات الأيضية من قبل العزل البيئي الميكروبي بناء على نموه المرئي على الحد الأدنى من ألواح أجار الوسائط ، وبواسطة GCMS. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نناقش إمكانية أن تكون الميكروبات قادرة على النمو على نفايات اللب وأننا قد نكون قادرين على عزل هذه الميكروبات مباشرة عن مطحنة اللب.

الميزة الرئيسية لتقنية استخراج السيلوز الزينال على الطريقة الحالية اليوم ، مثل تبييض هيدروكسيد الصوديوم ، هي أن تبييض كلوريد الصوديوم يوفر نقاء عاليا ومتزايدا. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. نظرا لأن خطوات إعداد عينة ثيو السليلوز و GCMS يصعب تعلمها ، ويرجع ذلك إلى عدد الخطوات المطلوبة وبسبب التحديد البصري المطلوب للتحقق من اكتمال العملية.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة للتدهور الميكروبي للخمور السوداء فحسب ، بل يمكن تطبيقها أيضا على مجاري النفايات الصناعية التي تحتوي على مواد Magno cellulose مثل بقايا المحاصيل ومخلفات الغابات والنفايات الصلبة البلدية. لبدء هذا الإجراء ، اجمع عينة الخمور السوداء من صمام المخرج المتصل بجهاز الهضم الحرفي وزجاجة زجاجية معقمة ، واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. ثم أضف 100 مل من عينة الخمور السوداء إلى دورق سعة 500 مل مزود بقضيب تحريك وحرك العينة بسرعة متوسطة.

قم بتحييد الخمور السوداء عن طريق إضافة حمض الفوسفوريك بالتنقيط حتى يصبح لزجا. بعد هذا الاقتباس كل محلول الخمور الأسود في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر وقم بالطرد المركزي للعينات عند 9 ، 300 Gs لمدة 30 دقيقة. لفصل الكربوهيدرات ، ضع خمسة جرامات من عشب التبديل المطحون بملليمتر واحد أو أصغر وقضيب التحريك في قارورة سعة 500 مل.

ثم أضف 200 مل من الماء المقطر و 7.5 جرام من كلوريت الصوديوم و 2.5 مل من حمض الخليك الجليدي. ضع القارورة في حمام زيت يوضع فوق طبق التحريك على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم أضف 7.5 جرام إضافية من كلوريد الصوديوم و 2.5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى القارورة.

استمر في التقليب على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد تكرار الخطوة السابقة مرتين. دع المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتصفيته من خلال قمع بوشنر تحت الفراغ لعزل المادة الصلبة.

اغسل المادة الصلبة ثلاث مرات ب 100 مل من الماء المقطر. بعد ذلك ، اجمع جراما واحدا من المادة الصلبة وضعها على ورقة نظيفة من ورق الترشيح. ضع المادة الصلبة على حرارة 50 درجة مئوية حتى تجف طوال الليل.

بعد إخراج العينة من الفرن في اليوم التالي ، انقلها إلى قارورة تخزين تحمل علامة خلية مجوفة. أضف المادة الصلبة المتبقية إلى قارورة سعة 500 مل تحتوي على 250 مل من هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 10٪ ، وقم بتغطية القارورة بالسدادة. ضع المحلول في حاضنة على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع رج عند 250 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، اترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة بعد 30 دقيقة ، قم بعزل المادة الصلبة عن طريق الترشيح الفراغي باستخدام قمع بوشنر. بمجرد تجفيف البقايا الصلبة طوال الليل في فرن 50 درجة مئوية ، ضعها في قارورة تخزين تحمل علامة السليلوز. انقل المرشح إلى قارورة سعة 500 مل وأضف 30 مل من حمض الأسيتيك و 250 مل من غطاء كحول الأيزوبروبيل وضع المحلول الناتج على سطح الطاولة لمدة ثماني ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

عند الانتهاء ، انقل كل المحلول إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للعينة عند 9 ، 300 Gs لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإخراج المحلول بعناية من الأنابيب المخروطية والتخلص منه. بعد ذلك ، اغسل الكريات ب 30 مل من الماء المقطر عن طريق الدوامة والطرد المركزي عند 9 ، 300 جم لمدة 30 دقيقة.

كرر هذه الخطوة 15 مرة لغسل الحبيبات جيدا. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية لعزل الحبيبات للتجفيف بالتجميد. بمجرد تجميد العينة ، ضعها في قارورة تحمل علامة هيمي السليلوز.

لفصل اللجنين ، أضف خمسة جرامات من عشب التبديل المطحون بمقدار ملليمتر واحد أو أصغر إلى محلول 500 مليلتر من هيدروكسيد الصوديوم المولي النقطة 25 ، و 30٪ إيثانول. ضع الملاط في حاضنة على حرارة 75 درجة مئوية مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد تصفية المحلول البارد ، أضف قضيب التحريك إلى القارورة وضعه فوق طبق التحريك المعدل على سرعة متوسطة.

أضف حمض الهيدروكلوريك المركز بالتنقيط إلى المرشح حتى يتم الحصول على درجة حموضة اثنين. اترك المحلول طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بمجرد نقل المحلول إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 9 ، 300 GS لمدة 30 دقيقة.

عند الانتهاء، قم بإخراج المحلول بعناية من الأنبوب المخروطي وتخلص منه. اغسل الحبيبات ب 30 مل من الماء المقطر عن طريق الدوامة والطرد المركزي عند 9 ، 300 جم لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة 15 مرة لغسل الحبيبات جيدا.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة القروض المستلقية لعزل الحبيبات للتجفيف بالتجميد. بمجرد تجميدها ، ضع العينة في قارورة تحمل علامة اللجنين. أضف 50 مل من الوسائط المعقمة M تسعة وسائط إلى قارورة معقمة سعة 125 مل.

ثم أضف 10٪ من حجم الخمور السوداء إلى الوسائط. للتلقيح ، أضف 0.1٪ من حيث حجم المزرعة البكتيرية الليلية إلى الخليط ، واحتضن المزارع عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة. في منتصف مرحلة السجل ، انقل البكتيريا إلى زجاجة مصل لاهوائية معقمة محكمة الغلق باستخدام حقنة بعد الطرد المركزي للمزارع البكتيرية الملقحة والملقحة من الأمم المتحدة.

بعد 450 ساعة من النمو ، أضف 10 مل من كل مادة طافية في أنابيب اختبار زجاجية منفصلة. قم بتحمض كل مادة طافية بحمض الهيدروكلوريك المركز المضاف بالتنقيط إلى درجة الحموضة من واحد إلى اثنين. لكل عينة ، أضف 30 مل من أسيتات الإيثيل إلى فوق الطبيعي.

بعد تغطية أنبوب الاختبار ، امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب من أربع إلى ست مرات. ثم ضع جراما إلى جرامين من كبريتات الصوديوم اللامائية في أنبوب اختبار زجاجي نظيف. اجمع الطبقة العضوية العلوية بعناية عن طريق سحب العينة باستخدام ماصة المراعي الزجاجية التي تستخدم لمرة واحدة.

ضع الطبقة العضوية في أنبوب الاختبار الذي يحتوي على كبريتات الصوديوم اللامائية. قم بإزالة المياه من الطبقة العضوية فوق كبريتات الصوديوم اللامائية عن طريق النقر برفق على أنبوب الاختبار للخلط تدريجيا. أضف كميات صغيرة من كبريتات الصوديوم اللامائية واخلطها حتى تختفي كتل كبيرة.

بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول من خلال قمع بوشنر تحت الفراغ ، ثم انقل المحلول إلى قارورة تبخير وتبخر المرشح باستخدام مبخر دوار. عند الانتهاء ، ضع ثلاثة ملليغرامات من بقايا استخراج أسيتات الإيثيل في قارورة كروماتوغرافيا كهرمانية سعة ملليلتر. قم بإذابة البقايا ب 100 ميكرولتر من أربعة ديوكسان و 10 ميكرولتر من البيريدين.

ثم أضف 50 ميكرولترا من محلول B-S-T-F-A مع 1٪ ثلاثي ميثيل الكلور إلى القارورة. ضع المحلول في حاضنة على حرارة 60 درجة مئوية مع الرج لمدة 15 دقيقة. تحليل العينة بواسطة GCMS.

سيؤدي جمع وتعديل الخمور السوداء المتولدة في عملية اللب الحرفية إلى استخدام نفايات اللب هذه لتحديد قدرة التحلل البيولوجي لعزل بكتيري واحد أو ثقافة مختلطة. يظهر هنا النمو الهوائي المقاس بالكثافة البصرية لسلالة بيئية مستزرعة في وسائط LB ووسائط LB مكملة بالخمور السوداء المعادلة بنسبة 10٪. تشير هذه النتائج إلى أن هذه البكتيريا تنمو في وجود الخمور السوداء.

يكون نمو العزلة البيئية في وسائط LB أسرع مما كان عليه عندما نمت في وجود الخمور السوداء ، لكن الكثافة البصرية تبدأ في الانخفاض بعد 62 ساعة. في حين أن نمو العزل البيئي الميكروبي في وجود الخمور السوداء يستمر في الزيادة في الكثافة البصرية حتى بعد 230 ساعة من النمو. يصور منحنى نمو العزلة البيئية الميكروبية في وجود الخمور السوداء أيضا نموا ثنائي الطور ، مما يشير إلى أن السائل الأسود يحتوي على أكثر من مصدر كربون يمكن استخدامه بواسطة العزل البيئي الميكروبي ، وأن هناك تفضيلا لاستخدام المغذيات الذي تظهره البكتيريا.

من الضروري إجراء مزيد من التجارب لتحديد قدرتها على استخدام الخمور السوداء لمتطلبات النمو. يمكن للمرء أيضا تحديد نمو البكتيريا على الخمور السوداء غير المعادلة أو تحديد تأثير زيادة تركيزات الخمور السوداء على النمو. بعد إظهار النمو على الخمور السوداء ، يمكن للمرء تحديد استخدام مصدر الكربون باستخدام الحد الأدنى من تجارب نمو الوسائط.

يمكن استخدام الركائز التجارية التي تشكل مكونات اللجنوسليلوز كمصادر للكربون في الحد الأدنى من الوسائط. يوفر بروتوكول استخراج LIGNOCELLULOSE المقدم هنا نموذجا لتحديد متطلبات نمو البكتيريا في الصورة هنا هو نمو العزلة الميكروبية البيئية على M nine. الحد الأدنى من أجار الوسائط مكمل بكل مكون من مكونات استخراج اللجنوسليلوز.

يشير وجود مستعمرات على الحد الأدنى من ألواح أجار الوسائط إلى قدرة العزلة البيئية على تحلل مستعمرات السليلوز الهولو والسليلوز والهيمي السليلوز واللجنين الموجودة في M تسعة. قد يشير الحد الأدنى من الوسائط إلى قدرة العزل البيئي على تدهور الأجار بدلا من الألواح. يمكن أيضا استخدام منحنيات نمو الوسائط الدنيا للمزارع السائلة لتحديد معدل النمو المحدد على كل جزء من الليجنوسليلوز بحيث لا يلزم إضافة أجار ، الذي يمكن أن يكون مصدرا محتملا للكربون.

يكشف تحليل العيون المستخرجة والمشتقة ، والثقافات البكتيرية بواسطة GCMS عن منتجات التمثيل الغذائي المنتجة. يظهر هنا طيف GCMS لمشتقات TMS الموجودة في العينة غير الملقحة ، طيف مشتقات TMS التي تنتجها العزل الميكروبي البيئي عند نموه بشكل لاهوائي و M nine ، الحد الأدنى من الوسائط مع 10٪ من الخمور السوداء غير المعادلة مصورة هنا. تكشف مقارنة الطفيفين عن اختلافات في المكونات الموجودة في الوسائط مما يشير إلى وجود منتجات التخمير وتدهور مكونات الخمور السوداء.

ظهرت ذروة مع وقت احتفاظ 39.34 دقيقة في العينة الملقحة. زادت الذروة مع وقت الاحتفاظ 21 نقطة 84 دقيقة في العينة الملقحة. انخفضت الذروة مع وقت الاحتفاظ 25.79 في العينة الملقحة.

الطيف الموضح هنا هو معيار guac ، والذي تم استخدامه لتحديد الذروة بزمن احتفاظ يبلغ 25.79 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ما إذا كانت الكائنات الحية الدقيقة أو مجموعة من الكائنات الحية الدقيقة يمكنها تحلل الخمور السوداء. علاوة على ذلك ، باتباع هذا البروتوكول ، يمكنك استخدام طرق أخرى مثل منحنيات النمو للإجابة على أسئلة إضافية حول معدل نمو الكائنات الحية الدقيقة أو الكائنات الحية الدقيقة على تركيزات مختلفة من الخمور السوداء أو مكونات مستخلص السليلوز الليجون.