Name: تلطيخ النسيجية من نبات الأرابيدوبسيس thaliana الخليوي الثانوية ستريت عناصر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: تعلم تقنيات التلطيخ النسيجي لعناصر الجدار الخلوي الثانوي في نبات Arabidopsis thaliana. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة تركيب الجدار الخلوي النباتي والأنسجة الليغنية في أبحاث علم النبات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن ممتنون لسابين رسل للمساعدة التحرير. وكان هذا العمل جزءا من معهد الطاقة الحيوية المشتركة وزارة الطاقة (http://www.jbei.org) بدعم من وزارة الطاقة الأميركية، مكتب العلوم ومكتب بحوث البيولوجية والبيئية، من خلال عقد DE-AC02-05CH11231 بين لورانس بيركلي مختبر الوطني ووزارة الطاقة الأميركية.

<ol><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li>
<li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+lignin+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry%E2%80%94past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry—past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li>
<li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li>
<li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li>
<li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li>
<li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technology%22%5BJournal%5D)">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li>
<li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence%3A+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloroglucinol+Stain+for+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li>
<li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakano%2C+J+%22The+Detection+of+Lignin+Methods+in+Lignin+Chemistry%22">The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).</li>
<li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+19th+Workshop%2FConference+of+the+Association+for+Biology+Laboratory+Education+%28ABLE%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li>
<li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li>
<li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+M%C3%A4ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li>
<li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li>
<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي صراعات مالية للكشف عنها.

وتستخدم على نطاق واسع أقسام الجذعية A. thaliana لدراسة تنظيم الخلايا في جدار الخلية والثانوية لدراسة نوعيا الاختلافات بين نوع البرية والنباتات المعدلة وراثيا. التقنيات المستخدمة عادة لباجتزاء العينات هي قطع اليد المباشر؛ أو عندما هي جزء لا يتجزأ العينات في الاغاروز أو تثبيتي، باجتزاء يمكن القيام به مع vibratome أو مبضع للفحص المجهري. وعلى النقيض من القطع من جهة، ومشاركة اثنين تسمح الحد من مخاطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن ط...

جدار الخلية النباتية يحمل مجموعة كبيرة من المعلومات ضمن مختلف مكوناته: اللجنين، السليلوز، hemicelluloses (الزيلان، glucuronoxylan، xyloglucan، arabinoxylan، الربط المختلطة جلوكان، أو glucomannan)، والبكتين. توفير التقنيات النسيجية الإشارات البصرية الهامة في دراسة الاختلافات داخل جدران الخلايا الثانوية في المستويات التنظيمية والخلوية. تم تطوير تقنيات النسيجية المختلفة ويمكن العثور عليها في الأدب، ولكن يمكن لهذه التقنيات أن يكون تحديا للمبتدئين وتستغرق وقتا طويلا لأن بروتوكولات مفصلة جدا مع تعليمات بسيطة ونادرا ما تكون مرئية إذا كان متوفرا من أي وقت مضى. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لتقنيات تلطيخ النسيجية للحصول على صور عالية الجودة. باجتزاء الأنسجة الجذعية هي الخطوة الأولى في التصور من جدران الخلايا والأشكال الخلية. على الرغم من المقاطع ومن ناحية القص غير مكلفة وتستغرق وقتا أقل للتحضير، واستخدام vibratome يقدم الاتساق وتعطي صور عالية الجودة. باستخدام vibratome يسمح إنتاج أفضل نوعية البيانات عن طريق توليد أقسام حتى مع نفس السمك، مما يساعد على إنتاج صور حادة ويقلل بشكل ملحوظ من خطر ينتج عنها اختلافات دقيقة بين العينات التي من شأنها أن يكون سبب ذلك ببساطة عن طريق إعداد عينة سيئة. يمكن باستخدام راتنجات لإصلاح العينات الطازجة يكون تحديا للمبتدئين ويمكن أن تكون لا تزال تستغرق وقتا طويلا حتى بالنسبة للخبراء عندما يحتاج تحليلا ينبغي القيام به بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، يصبح من المستحيل لقياس أي نشاط بيولوجي مع العينة عندما تم تضمين ذلك في الراتنج. أسلوب واحد بسيط هو أن توظف الاغاروز والعفن محلية الصنع هي مفيدة لتضمين الأنسجة الجذعية، ويمكن أيضا أن تستخدم في تطبيقات أخرى تتطلب تشريح الأنسجة الرخوة. بالمقارنة مع تضمين العينات في الراتنج، وهذا الأسلوب له ميزة الحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة والحد من التلاعب العينة. باجتزاء الأنسجة عن طريق vibratome هو دقيق للغاية ويولد homogenأقسام الأوس، والتي، اعتمادا على الهدف من الدراسة، ومن ثم يمكن استخدامها مع العديد من التقنيات تلطيخ مختلفة. أبسط الطرق لتصور اللجنين والمواد العطرية الأخرى تستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء. الإثارة من الجزيئات العطرية مقرها من قبل ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي تقنية قديمة، ولكنها لا تزال واحدة من أسرع النهج لرؤية اللجنين. ومع ذلك، والتصور للأشعة فوق البنفسجية هو في الواقع ليست مثالية للكشف عن اللجنين لضوء الأشعة فوق البنفسجية سوف تثير العطرية الأخرى. يتكون اللجنين في المقام الأول من ثلاث كتل بناء، وmonolignols (الكحول hydroxycinnamyl: الكحول coniferyl والكحول sinapyl، وف coumaryl الكحول) 1-3. يمكن فلوروغلوسين صمة عار توفر أدلة على مدى cinnamaldehydes الموجودة في الخشب والألياف والأنسجة القصبة الهوائية 4. فلوروغلوسين يعد مؤشرا جيدا من cinnamaldehydes العامة ويمكن التفريق بين cinnamaldehydes والعطرية الأخرى. ويمكن الكشف عن الكحول مونومرات sinapylومتمايزة عن طريق استخدام مولي وصمة عار. طولويدين يا الأزرق هو صبغة متعدد الألوان، ولديه القدرة وصمة عار عناصر مختلفة من جدار الخلية في ألوان مختلفة 5،6 بالتالي. الاستخدام الرئيسي للطولويدين يا الأزرق هو للكشف عن البكتين واللجنين 5،6. ميزة استخدام طولويدين يا الأزرق هو أن العديد من عناصر جدار الخلية يمكن تصور في خطوة واحدة. كلا calcofluor الأبيض والكونغو الحمراء هي سهلة للعمل مع، ويمكن استخدامها لتصور السليلوز. Calcofluor البقع البيضاء السليلوز، callose، وغيرها من β جلوكان غير استبداله أو استبداله ضعيفة 6-9، في حين الكونغو البقع الحمراء مباشرة إلى β (1 → 4) جلوكان وبشكل خاص لالسيليلوز 10،11. الهدف من هذه الدراسة هو تقديم الإرشادات البسيطة لاستخدام التقنيات تلطيخ المذكورة أعلاه للحصول على صور عالية الجودة من A. ينبع thaliana.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>رقم CAS: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1،3،5-trihydroxybenzene [رقم CAS: 108-73-6]</td></tr> <tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>رقم CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>هيدروكسيد الأمونيوم</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>رقم CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>توليدين بلو أو</td><td>سيجما</td><td>T3260</td><td>كلوريد بلوتين, كلوريد التلونيوم [رقم سجل المستخلصات الكيميائية 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>برمنجنات البوتاسيوم</td><td>سيجما</td><td>223468</td><td>رقم سجل المستخلصات الكيميائية 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>الإيثانول 190 دليل</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>رقم CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>الكونغو الأحمر</td><td>سيجما &nbsp;</td><td>C6277</td><td>ثنائي الصوديوم 3،3'- [[1،1'-ثنائي الفينيل] -4،4'-diylbis (azo)] مكرر (4-أمينوأفثالين 1-سلفونات) [رقم سجل المستخلصات الكيميائية 573-58-0]</td></tr> <tr><td>منير الفلورسنت 28 / كالكوفلور صبغة بيضاء</td><td>Sigma</td><td>F3543 &nbsp ؛</td><td>4،4'-مكرر [[4-[مكرر (2-هيدروكسي إيثيل) أمينو] -6-أنيلينو-1،3،5-تريازين-2-يل] أمينو] ستيلبين -2،2 '-حمض ديسولفونيك [رقم سجل المستخلصات الكيميائي 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica تهتز شفرة microtome VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety الحلاقة شركة البند</td><td># 60-0139-0000&nbsp;</td><td>شفرة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ (Personna Super)</td></tr>أنابيب <tr><td>الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء اللولبي (2 مل) VWR</td><td></td> <td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (0.6 مل)</td> <td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Mitt</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; حامي اليد الساخنة ميت</td></tr><tr><td>لاصق المناديل</td><td>اللاصقة تيد بيلا</td><td>10033</td><td>مخزن في 4 درجات ؛ C أو 20 درجة ؛ C لمدة 3 أشهر أو أكثر تخزين</td></tr><tr><td>ميكروويف</td><td>باناسونيك</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 لاصق مناديل فوري &nbsp ؛</td></tr><tr><td>كاميرا مع رقاقة CCD مع عدم وجود مصراع ميكانيكي&nbsp;</td><td>كاميرا ملونة عالية السرعة Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>كاميرا البرمجيات&nbsp;</td><td>&nbsp; الأجهزة الجزيئية</td><td>MetaMorph الإصدار 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>تخيل التحليل&nbsp;</td><td>أدوبي&nbsp;</td>نظارات <td>فوتوشوب CS4</td><td></td></tr><tr><td>ذات غطاء صغير ، مربعة ، رقم 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 × 22 مم (7/8 × 7/8 بوصة) - نظارات الغطاء مقاومة للتآكل وسميكة ومسطحة بشكل موحد. السماكة رقم 1 من 0.13 إلى 0.17 مم.</td></tr>شرائح <tr><td>مايكرو بلوري ، 1 مم</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 × 25 مم - 1 مم</td></tr><tr><td>تغليف بارافيلم M</td><td>Alcan</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 مكعب مرشح</td><td>Leica</td><td>11513851 / 11513885</td><td>مرشح يستخدم لتحليل الكونغو الأحمر مع تمرير نطاق 560/40.</td></tr></tbody></table>

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana هو كائن حي نموذجي يستخدم بشكل شائع لفهم العمليات الخلوية المختلفة في النباتات ومعالجتها ، وقد تم استخدامه على نطاق واسع في دراسة تكوين جدار الخلية الثانوي. يحدث ترسب جدار الخلية الثانوي بعد وضع جدار الخلية الأساسي ، وهي عملية يتم تنفيذها حصريا بواسطة خلايا متخصصة مثل تلك التي تشكل أنسجة الأوعية الدموية والألياف. تتكون معظم جدران الخلايا الثانوية من السليلوز (40-50٪) والهيميسليلوز (25-30٪) واللجنين (20-30٪). تم عزل العديد من الطفرات التي تؤثر على التخليق الحيوي لجدار الخلية الثانوي ، وقد تظهر الطفرات المقابلة أو لا تظهر تغيرات واضحة في التركيب الكيميائي الحيوي أو الأنماط الظاهرية المرئية حيث يمكن إخفاء هذه الطفرات من خلال الاستجابات التعويضية. تم استخدام إجراءات التلوين تاريخيا لإظهار الاختلافات على أساس خلوي. هذه الأساليب هي وسائل تحليلية مرئية حصرية. ومع ذلك ، فإن دورها في التحليل السريع والنقدي له أهمية كبيرة. الكونغو الأحمر والأبيض الكالكوفلوري هي بقع تستخدم للكشف عن السكريات ، بينما يشيع استخدام Mäule و phloroglucinol لتحديد الاختلافات في اللجنين ، ويستخدم التولودين الأزرق O لصبغة السكريات واللجنين بشكل تفاضلي. يمكن أن تشكل التقنيات التي تبدو بسيطة للتقسيم والتلوين والتصوير تحديا للمبتدئين. بدءا من تحضير العينة باستخدام نموذج A. thaliana ، توضح هذه الدراسة بالتفصيل بروتوكولات مجموعة متنوعة من منهجيات التلوين التي يمكن تنفيذها بسهولة لمراقبة تنظيم الخلايا والأنسجة في جدران الخلايا الثانوية للنباتات.

وقف تضمين وباجتزاء: استخدام قالب من البلاستيك محلية الصنع لتضمين ينبع في 7٪ الاغاروز ثبت أن تكون سريعة وسهلة (الشكل 1). شطري (A و B؛ الشكل 1) من النظام قارورة جزءا لا يتجزأ من جعلها بسيطة لاطلاق سراح بسهولة الجذعية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز كما الاغاروز لا التمسك أجزاء القارورة التي هي خاملة، والحفاظ على نظام نظيفة. قارورة يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لسنوات. راحة تخزين الجذعية جزءا لا يتجزأ أيضا يجعل الخطوات المقبلة أسهل. من أجل إنقاذ في ...

يختلف تكوين جدار الخلية النباتية بين أنواع الأنسجة ويمكن أن يشمل اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز والبكتين. تم تطوير تقنيات تلوين مختلفة لتصور الاختلافات على مستوى نوع الخلية. هذه الورقة عبارة عن مجموعة من تقنيات تلطيخ جدار الخلية شائعة الاستخدام.

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار الصبغ الكيميائي النسيجي لعناصر الجدار الخلوي الثانوي ANA في نبات Arabidopsis. يتم تحقيق ذلك عن طريق دمج ساق النبات أولاً في مادة aros. بعد ذلك، يتم إخراج الساق المدمجة في aros ونقلها إلى أقراص العينات، والتي يتم تقطيعها لاحقاً إلى مقاطع عرضية في الساق باستخدام جهاز vibrato.بعد ذلك، تخضع المقاطع لإجراءات صبغ كيميائي نسيجي متنوعة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر لإظهار التغيرات التفاضلية في عناصر الجدار الخلوي الثانوي التي تم الحصول عليها من خلال الصبغ الكيميائي النسيجي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالجدار الخلوي، مثل تغيرات الأنسجة البقعية في سيقان النباتات.بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الخطوات البسيطة والحاسمة المذكورة في البروتوكولات هنا لم يتم توثيقها بدقة أو تقديمها بطريقة مبسطة من قبل. للبدء، قم بإعداد قالب منزلي لصب السيقان باستخدام أنابيب بلاستيكية. أولاً، استخدم شفرة حلاقة لقطع القاع المخروطي لأنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 mL وله غطاء لولبي.يُشار إلى هذا المكون باسم الجزء A، مع وجود ثقب بإبرة حقنة في غطاء الأنبوب يكون أكبر قليلاً من قطر الساق المراد تضمينها. بعد ذلك، يتم قطع نصف سنتيمتر من قاع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 milliliter. سيُشار إلى هذا المكون باسم الجزء B. أضف الجزء المقطوع بطول نصف سنتيمتر من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 milliliter إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 milliliter المقطع مسبقاً.أحكم إغلاق الجزأين باستخدام البارافورم. وباستخدام شفرة حلاقة، اقطع مقطعاً من الساق من المنطقة المراد دراستها، ثم قم بصهر محلول aros بتركيز 7% في الميكروويف بكثافة منخفضة. وبمجرد أن يبرد الـ aros المصهور إلى حوالي 50 °C، اسحب ببطء باستخدام الماصة 5 mL من الـ agros وضعها في القالب البلاستيكي المعد مسبقاً لملء القارورة.بعد أن يبرد الـ aros لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية ويصبح شبه صلب، ضع الساق داخل القارورة المملوءة بالـ aeros. ثم ضع الغطاء المثقوب بطريقة تجعل طرف الساق مثبتاً بواسطة الغطاء. اترك القارورة في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة حتى يتصلب.أزل القالب عن طريق سحبه برفق خارج الأنبوب. افتح غشاء البارافيلم واضغط برفق بإبهامك على الجزء السفلي من الجزء B من القالب لتحرير الـ aros المتصلب من الجزء A فوق شريحة مجهر زجاجية. قم بإجراء قطع شرائحي.قُم بتقطيع الساق المدمجة في الحلقة إلى ثلاث قطع متساوية تقريباً بطول 1.2 centimeters لكل منها. اقطع الجزء من الساق الذي لم يكن داخل الحلقة وتخلص منه. تأكد من أن قرص العينة نظيف وجاف تماماً.استخدم مناديل ورقية ناعمة لإزالة أي رطوبة من كتلة aros التي تحتوي على العينات. ضع قطرة صغيرة من لاصق الأنسجة على قرص العينة. ضع كتلة aros بسرعة بحيث تكون العينات إما عمودية على الشريحة للحصول على مقاطع عرضية مستعرضة أو موازية للشريحة.بالنسبة للمقاطع العرضية الطولية، اترك المادة اللاصقة لتثبيت العينة على قرص العينة في درجة حرارة الغرفة أو عند أربع درجات Celsius لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة. ثبت قرص العينة في مكانه على صينية المحلول المنظم أو من خلال كتلة التثبيت بحيث تكون المقاطع موازية لشفرة الحلاقة. املأ صينية المحلول المنظم بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة حتى تغمر العينات تماماً.اقطع شفرة حلاقة إلى نصفين ثم قم بتقليم النهايات باستخدام مقص متين بحيث تظل الشفرة مسطحة تماماً. ثبّت نصف شفرة الحلاقة المقطوعة مسبقاً على حامل السكين. اضبط الزاوية في حامل السكين على 84 درجة والسرعة على 0.90 millimeters per second والتردد على 50 hertz.قم بقطع المقاطع بسمك 100 micron باستخدام الوضع المستمر. اجمع المقاطع باستخدام ماصة بلاستيكية مخصصة للاستخدام مرة واحدة أثناء عملية القطع في حوض المحلول المنظم. انقل بضع مقاطع إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 milliliter لصبغها بـ fluorol.انقل مقاطع الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 1 mL من محلول الفلورول إلى الأنبوب وأغلقه فوراً. ونظراً لأن حمض الهيدروكلوريك الموجود في صبغة الفلورو-جلوكانول مسبب للتآكل بدرجة عالية، حرك الأنبوب برفق للتأكد من صبغ جميع المقاطع.انقل المقاطع برفق باستخدام ماصة إلى طرف ماصة مقطوع ثم ضعها على شريحة مجهرية. غطِّ المقاطع بغطاء شريحة. افحص المقاطع تحت إضاءة المجال المضيء.يجف المحلول في غضون 5 إلى 10 دقائق، مما يؤدي إلى تدهور العينات. لذا، يجب إكمال عملية التصوير خلال هذه الفترة الزمنية. ولإجراء الصبغ، انقل قطاعات الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.أضف 1 mL من محلول بيرمنغنات البوتاسيوم بتركيز 0.5% إلى الأنبوب الذي يحتوي على المقاطع. استخدم الماصة لسحب ودفع محلول بيرمنغنات البوتاسيوم 0.5% برفق، ويفضل أن يكون ذلك دون تحريك المقاطع. بعد فترة تحضين مدتها دقيقتان وتكرار عملية السحب والدفع بالماصة، اترك أنبوب الطرد المركزي الدقيق دون تحريك حتى تترسب جميع المقاطع في القاع.باستخدام ماصة سعة 1 مل، اسحب 700 µL من محلول Potassium permanganate بتركيز 0.5%، ثم أضف 700 µL من الماء المقطر لشطف Potassium permanganate. كرر هذه العملية من ثلاث إلى أربع مرات أو حتى يظل المحلول المائي صافياً. بعد التخلص من الماء، أضف بسرعة 1 مل من hydrochloric acid بتركيز 3% حتى يزول اللون البني الداكن من المقاطع.قد يحدث هذا خلال ثلاث إلى خمس دقائق، أو قد يتطلب الأمر غسلتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. قم بسحب محلول حمض الهيدروكلوريك 3% بالكامل باستخدام الماصة، ثم أضف فوراً 1 mL من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المركز. وقبل التصوير تحت إضاءة المجال المضيء لصبغة الكونغو الحمراء، انقل مقاطع الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف 1 mL من محلول صبغة الكونغو الحمراء 0.5%.قم بسحب ودفع محلول Congo red بتركيز 0.5% برفق باستخدام الماصة دون تحريك المقاطع. وقبل تحضين المقاطع وغسلها كما هو موضح في البروتوكول النصي، انقل العينات المشرّحة برفق باستخدام طرف ماصة مقطوع إلى شريحة مجهرية. ثم قم بتغطيتها بغطاء شريحة.افحص العينات تحت المجهر. حرك الشريحة تحت استثارة الضوء الأزرق باستخدام مرشح انبعاث 560 nanometer لصبغة calcior white. انقل قطاعات الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف 1 mL من محلول calcior white بتركيز 0.02%.قم بسحب المحلول ودفعه بلطف باستخدام الماصة. انتقل إلى تحضين المقاطع وغسلها كما هو مفصل في البروتوكول النصي قبل فحص المقاطع تحت الضوء فوق البنفسجي UV. وبالنسبة لصبغة toluidine blue o، انقل مقاطع الساق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول toluidine blue O بتركيز 0.02% إلى الأنبوب، ثم قم بسحب المحلول ودفعه برفق باستخدام الماصة. بعد ذلك، قم بتحضين المقاطع وغسلها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب قبل فحصها تحت إضاءة المجال المضيء. راجع البروتوكول المكتوب للحصول على تفاصيل حول إعدادات المجهر والكاميرا للتصوير، بالإضافة إلى إجراءات التصوير بالأشعة فوق البنفسجية والمجال المضيء.يمكن تصور المركبات العطرية، بما في ذلك اللجنين في الخلايا، من خلال تألقها الذاتي تحت الأشعة فوق البنفسجية. أظهر الخشب والألياف البينية تألقاً ذاتياً تحت الإضاءة بالأشعة فوق البنفسجية، ولكن لم يظهر ذلك في النخاع والقشرة أو البشرة لأن اللجنين والبوليمرات العطرية تترسب أثناء التخليق الحيوي للخلايا الثانوية، بينما يتفاعل صبغ الفلورول مع مجموعات الألدهيد الطرفية في اللجنين ليعطي لوناً وردياً أو فوشياً كما لوحظ تحت الإضاءة بالأشعة فوق البنفسجية. ويلاحظ تلون فوشي في الخشب والألياف البينية، ولكنه يغيب في النخاع والقشرة أو البشرة.عادةً ما ترتبط شدة اللون بمستوى التخشب بطريقة نوعية. وتتميز صبغة MALS بكونها متخصصة في الكشف عن وحدات ليجنين ingal في الخشب والألياف البينية. ويشير اللون الأحمر إلى وجود وحدات ليجنين ingal في عناصر الليجنين.ومع ذلك، يُلاحظ تلون أحمر أكثر سطوعاً في الألياف مقارنة بأنسجة الخشب، مما يشير إلى أن الألياف تحتوي على مستوى أعلى من لجنـين الـ ingal، بينما يكون الخشب أكثر غنى بوحدات لجنـين الـ gua. وبفحص مقاطع الساق المصبوغة بـ calcior white تحت الأشعة فوق البنفسجية UV، تبين تلون البشرة والقشرة والنخاع، وذلك لأن جميع هذه الأنسجة تحتوي على السليلوز كبوليمر عديد تسكر رئيسي في جدران خلاياها. كما لوحظ أن المقاطع المصبوغة بـ Congo red تحت إثارة الضوء الأزرق قد صبغت أيضاً البشرة والقشرة والنخاع.على عكس كاشف calcior، صبغت صبغة Congo red السكريات المتعددة بشكل أفضل في الخشب والألياف البينية، وبدت أقل تأثراً بوجود اللجنين. تُصنف صبغة Odine Blue O كصبغة متعددة الألوان لأنها تنتج عينة متعددة الألوان. وتُعد Odine blue O صبغة أيونية ترتبط بالمجموعات سالبة الشحنة وتولد ألواناً مختلفة.عندما ترتبط الصبغة بمجموعات أيونية مختلفة في الخلية، كشف صبغ تين بلو O لمقاطع عرضية من الساق أن الخشب والألياف بين الحزم هي أنسجة مغلظة باللجنين لأنها تظهر تلوناً أزرق مخضراً أو أزرق، وهو ما يتوافق مع نتائج الأشعة فوق البنفسجية واختبار الفلورو-جلوكان. وفي المقابل، أظهرت جميع ملاحظات التلوين أن أنسجة النخاع والقشرة والبشرة تظهر تلوناً أزرق مخضراً أو أزرق لأنه على الرغم من عدم تغلظها باللجنين، إلا أنها تحتوي على بعض بوليمرات البكتين في جدران خلاياها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل مقاطع عرضية لسيقان النباتات وكيفية تلوين الأنسجة المختلفة في جدار الخلية النباتية تلويناً تفريقياً باستخدام صبغات كيميائية نسيجية مختلفة.

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تلطيخ Wiesner لتلوين اللجنين الموجود في الخلايا النباتية المتخصصة. تساعد تقنية التلوين هذه على تصور جدران الخلايا الخشنة في سيقان نبات الأرابيدوبسيس thaliana وتساعد على تحديد كمية التقشير في جدران الخلايا لأنواع مختلفة من الخلايا.

تلطيخ Wiesner لتصور اللجنين: تقنية لتلطيخ رواسب اللجنين الموجودة في سيقان نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا

في هذا الفيديو ، نصف تقنية تلطيخ Maule لتلوين لجنين الحقن الموجود في الخلايا النباتية المتخصصة. تساعد تقنية التلوين هذه على توصيف توزيع اللجنين في نسيج الخشب والألياف بين اللفافة.

تلطيخ اللول للجنين: تقنية لتوصيف توزيع اللجنين في أقسام ساق أرابيدوبسيس ثاليانا

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة تلطيخ الكونغو الأحمر لتصور رواسب السليلوز في أقسام ساق نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا.

تلطيخ الكونغو الأحمر: تقنية لتصور رواسب السليلوز في أقسام جذع النبات

في هذا الفيديو ، نصف إجراء تلطيخ لتصور ترسب السليلوز داخل جدران خلايا نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا ، وهو نبات ثنائي الفلقة ، باستخدام اللون الأبيض الكالكوفلوري ، والذي يرتبط على وجه التحديد بالجلوكان المرتبط β ، ويظهر التألق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تلطيخ الكالكوفلور الأبيض: طريقة بسيطة لتصور التألق الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية لرواسب السليلوز في جدران الخلايا للأقسام الجذعية لنبات ثنائي الفلقة

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ مناعي لتوطين بروتينات أرابينوجالاكتان (AGPs) والبكتين في الأنسجة النباتية. يتم تلطيخ أقسام الأنسجة النباتية الثابتة والمضمنة بالراتنج بالأجسام المضادة الأولية والفلورية الخاصة ب AGP والبكتين وصبغة فلورية مرتبطة بالسليلوز للكشف عن توضعها الخاص بالأنسجة في جدار الخلية.

توطين مناعي لبروتينات أرابينوجالاكتان والبكتين في الأنسجة النباتية

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

في هذا البروتوكول، نحن تصف التقنيات لتشريح سليم من نبات الزهور وسيليكويس، بعض تقنيات مسح الأساسية، وتحديد تلطيخ إجراءات الملاحظات جبل كل الهياكل الإنجابية.

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفيه تحميل CFDA إلى مواقع مختلفه من الأجزاء السفلية من Arabidopsis. ثم نقدم نمط التوزيع الناتج من CF في البراعم.

حركه إطلاق النار من الراسم CFDA المحملة في الانسجه بالوعة القاع من Arabidopsis

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إصلاح المواد النباتية لإضفاء الطابع المناعي على البروتينات والبكتين العربي ، وجزءًا من راتنج الأكريليك المائي ، المقطع والمثبت على الشرائح الزجاجية. نظهر سيتم الكشف عن epitopes جدار الخلية ذات الصلة مع الأجسام المضادة محددة.

الفلورسنت المناعية من البروتينات و البكتينات أرابينغالات في جدار الخلية من الأنسجة النباتية

يتم تقديم العديد من الطرق الشائعة الاستخدام هنا لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء لمستقبلات غشاء البلازما كيناز. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات التفصيلية بما في ذلك تحضير المواد النباتية والمعالجة الدوائية وإعداد التصوير متحد البؤر.

الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور

يصف هذا البروتوكول تحضير عينات سليمة من طبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا . لا تتطلب هذه الطريقة سوى معدات مختبرية شائعة ، مثل إبرة الحقن والملقط الدقيق ، وتتيح تصوير الخلايا الحية الفلورية عالية الدقة لخلايا السويداء في كل من البذور النامية والناضجة.

تحضير الأنسجة السليمة للتحليل المجهري لطبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس النامية والناضجة

تعلم تقنيات التلطيخ النسيجي لعناصر الجدار الخلوي الثانوي في نبات Arabidopsis thaliana. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة تركيب الجدار الخلوي النباتي والأنسجة الليغنية في أبحاث علم النبات.

تلطيخ النسيجية من

استكشف المزيد من الفيديوهات