التصوير مسح النظم البيولوجية السليمة على المستوى الخلوي عن طريق 3DISCO

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير عينات بيولوجية سليمة مصنفة فلورسنت دون تقسيم نسيجي. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحضانة المتسلسلة للأنسجة الثابتة في المذيبات العضوية حتى يتم تحقيق الشفافية الكاملة. كخطوة ثانية.

يتم تصوير الأنسجة الشفافة ثلاثية الأبعاد باستخدام مجهر المسح بالليزر. بعد ذلك ، يتم تحليل نتائج التصوير ويمكن إعادة بناء الهياكل العصبية في الحبل الشوكي والدماغ المقطوع بشكل ثلاثي الأبعاد من صور الديسكو الثلاث التي تم جمعها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب فيما يتعلق بكيفية رسم خريطة للاتصالات العصبية و GAL في الدماغ والحبل الشوكي بأكمله.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج التنكس العصبي حيث يمكننا الآن تصور السلامة العصبية في جميع أنحاء الجهاز العصبي بأكمله. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم الجهاز العصبي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أعضاء أخرى مثل أنسجة الرئة أو الورم. بمجرد إتقانها ، تستغرق هذه التقنية بضع ساعات فقط للأعضاء الصغيرة مثل الحبل الشوكي أو الرئة ، وحوالي يوم أو يومين للدماغ ابدأ الإجراء بإضافة ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من 50٪ THF المحضرة حديثا إلى قارورة زجاجية واحدة لكل نسيج محصود.

ثم انقل الأعضاء الثابتة إلى محلول المقاصة وأغلق القوارير بإحكام. ضع القوارير على دوار وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم ، مع تحريك العينات للوقت المناسب بسرعة ثابتة تبلغ 30 دورة في الدقيقة. ثم قم بإزالة محلول المقاصة واستخدم PE أو ماصة جديدة لتعليق الأنسجة في المحلول التالي.

كما هو موضح في الجدول أثناء خطوة المقاصة النهائية ، احتفظ بالعينات في المحلول حتى تصبح شفافة تماما للفحص المجهري متعدد الفوتون أو متحد البؤر. بمجرد تحقيق المقاصة الكاملة ، قم بتركيب العينة على شريحة تصوير لهذه الغاية. استخدم أسمنت الأسنان لعمل حدود حول الأنسجة.

املأ المسبح بمحلول المقاصة النهائي قبل أن يصبح أسمنت الأسنان صلبا تماما ، ثم ضع العينة التي تم تطهيرها على الفور في منتصف المسبح وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي. اضغط على زجاج الغطاء حتى يتم إغلاقه تماما بواسطة أسمنت الأسنان ويلامس سطح العضو الذي تم تطهيره للفحص المجهري للصفائح الخفيفة بمجرد تحقيق المقاصة الكاملة ، ثم قم بتدوير المسمار اللولبي لحامل العينة يدويا لإصلاح العينة. بعد ذلك ، اغمس العينة في غرفة التصوير لمجهر الورقة الضوئية المملوءة بمحلول المقاصة النهائي المناسب للأنسجة المصورة.

ثم اجمع عمليات مسح Z التي تغطي الأنسجة التي تم تطهيرها بالكامل بأفضل دقة يمكن أن يقدمها المجهر ، مع تكبير المناطق ذات الاهتمام لجمع صور عالية الدقة. بعد جمع الصور ، قم بتحميل سلسلة الصور في برنامج Amira باستخدام وحدة حل RT. عند تحميل السلسلة ، أدخل أحجام فوكسل الصحيحة في نافذة معلمة قراءة الصورة وانقر فوق موافق.

بعد ذلك ، حدد التطبيق الفرعي للعرض متعدد المستويات. ثم استخدم منزلقات الإسقاط الأساسية والسمكية لاختيار سمك الإسقاط الأمثل والحد للقيم الرمادية. أخيرا ، استخدم وحدة زاوية الاقتصاص لتصفح الشرائح في اتجاهات ثلاثية الأبعاد مختلفة.

لتصور العينات ، يعد رسم خرائط التنظيم الهيكلي للخلايا العصبية أمرا مهما للغاية لفهم كيفية عملها في الصحة والمرض. بينما يمكن استخدام ثلاثة ديسكو على أعضاء مختلفة ، إلا أنها مفيدة بشكل خاص لتتبع الوصلات العصبية الطويلة في النخاع الشوكي والدماغ. على سبيل المثال ، باستخدام فحوصات الفحص المجهري الفائق لأجزاء الحبل الشوكي الكبيرة التي تم تطهيرها ، يمكن متابعة الوصلات المحورية على مدى سنتيمترات في الحبل الشوكي للقوارض كما هو موضح في هذه الصور.

بطريقة مماثلة ، يمكن تصوير دماغ الفأر والحصين بالكامل لمتابعة الروابط العصبية في الدماغ. عند استخدام الفحص المجهري متحد البؤر أو متعدد الفوتون ، يمكن تحسين دقة التصوير بشكل كبير ، خاصة في البعد Z. على سبيل المثال ، يحقق التصوير متعدد الفوتون للحبال الشوكية التي تم تطهيرها من الفئران الخطية GFPM صورة سلسة في جميع أنحاء عمق 1.5 إلى ملليمترين من الحبل الشوكي.

الفحص المجهري متحد البؤر على الحبل الشوكي الذي تم تطهيره دقة محسنة بطريقة مماثلة. يوفر التصوير المجهري متعدد الفوتون للأدمغة التي تم تطهيرها صورا عالية الدقة لتصور التفاصيل الدقيقة للهياكل العصبية ، بما في ذلك العمود الفقري المتغصن. يمكن تسمية عينات ثلاثة ديسكو بطرق مختلفة.

على سبيل المثال ، من الممكن تسمية الأوعية الدموية بأكملها في الدماغ والحبل الشوكي باستخدام متتبعات الفلورسنت المترافقة بالليكتين ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الحاجز الدموي الدماغي في الصحة والمرض. باستخدام ثلاث خلايا صغيرة في الأنسجة الكبيرة يمكن أيضا تصويرها. على سبيل المثال ، تتورط كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية بشكل كبير في أمراض التنكس العصبي ، بما في ذلك مرض الزهايمر والإصابات المؤلمة.

باستخدام ثلاثة ديسكو ، يمكن دراسة كثافتها وتوزيعها في النخاع الشوكي. يمكن أيضا تصوير الأنسجة غير العصبية. على سبيل المثال ، يمكن تصنيف خلايا كلارا في رئتي القوارض بأكملها بأجسام مضادة وتصويرها دون تقسيم على مستوى خلية واحدة.

وبالمثل ، من الممكن مسح الخلايا وتصويرها في أنسجة البنكرياس غير المصرح بها. على سبيل المثال ، يتم تصوير خلايا ألفا المصنفة بالفلورسنت بعد المسح في صور البنكرياس هذه. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما لأنه في حين أن خطوات المقاصة والتصوير واضحة ومباشرة ، إلا أن تحليل البيانات يمكن أن يكون معقدا.

أثناء تطبيق هذا الإجراء ، من المهم تصوير الأنسجة الصافية بمجرد تحقيق الشفافية الكاملة لأن إشارة الفلورسنت ستتحلل بمرور الوقت في محلول المقاصة. مهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف التفاصيل والأعضاء السليمة ، مثل رسم خرائط الشبكات العصبية في الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مسح وتصوير الهياكل الخلوية وتحت الخلوية في الأعضاء بأكملها ، وبالتالي تصورها وتحليلها.