التصوير مسح النظم البيولوجية السليمة على المستوى الخلوي عن طريق 3DISCO

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير عينات بيولوجية سليمة وموسومة فلورياً دون الحاجة إلى إجراء تقطيع نسيجي. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحضانة المتتالية للأنسجة المثبتة في مذيبات عضوية حتى يتم الوصول إلى شفافية كاملة. وكخطوة ثانية.

يتم تصوير الأنسجة الشفافة ثلاثياً الأبعاد باستخدام مجهر مسح ليزري. بعد ذلك، تُحلل نتائج التصوير ويمكن إعادة بناء الهياكل العصبية في الحبل الشوكي والدماغ غير المقطعية ثلاثياً الأبعاد من صور disco الثلاث التي تم جمعها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علوم الأعصاب فيما يتعلق بكيفية رسم خرائط الاتصالات العصبية و GAL في الدماغ والحبل الشوكي بأكملهما.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج التحلل العصبي، حيث أصبح بإمكاننا الآن تصور السلامة العصبية في جميع أنحاء الجهاز العصبي. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة حول تنظيم الجهاز العصبي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أعضاء أخرى مثل الرئة أو الأنسجة الورمية. وبمجرد إتقانها، تستغرق هذه التقنية بضع ساعات فقط للأعضاء الصغيرة مثل النخاع الشوكي أو الرئة، وحوالي يوم أو يومين للدماغ. ابدأ الإجراء بإضافة 2 إلى 3 mL من 50%THF المحضر حديثاً إلى قارورة زجاجية واحدة لكل نسيج تم حصاده.

ثم انقُل الأعضاء المثبتة إلى محلول الترويق وأغلق القوارير بإحكام. ضع القوارير على جهاز تدوير (rotator) وغطِّها بورق ألومنيوم، مع تحريك العينات للمدة المناسبة وبسرعة ثابتة تبلغ 30 RPM. بعد ذلك، قم بإزالة محلول الترويق واستخدم أداة نقل (PE) أو ماصة جديدة لتعليق النسيج في المحلول التالي.

كما هو موضح في الجدول خلال خطوة الترويق النهائية، تُحفظ العينات في المحلول حتى تصبح شفافة تماماً من أجل المجهر متعدد الفوتونات أو المجهر البؤري. وبمجرد تحقيق الترويق الكامل، يتم تثبيت العينة على شريحة تصوير لهذا الغرض. استخدم الأسمنت السني لعمل إطار حول النسيج.

املأ الحوض بمحلول التصفية النهائي قبل أن يتصلب الإسمنت السني تماماً، ثم ضع العينة المصفاة على الفور في منتصف الحوض وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي. اضغط على الغطاء الزجاجي حتى يتم إغلاقه تماماً بواسطة الإسمنت السني ويلامس سطح العضو المصفى من أجل تجهيزه لمجهر الصفائح الضوئية بمجرد تحقيق تصفية كاملة، ثم أدر برغي حامل العينة يدوياً لتثبيتها. بعد ذلك، اغمر العينة في غرفة التصوير الخاصة بمجهر الصفائح الضوئية المملوءة بمحلول التصفية النهائي المناسب للنسيج الذي يتم تصويره.

بعد ذلك، قم بجمع مسوحات Z التي تغطي كافة الأنسجة المصفاة بأفضل دقة يمكن أن يوفرها المجهر، مع تكبير مناطق الاهتمام لجمع صور ذات دقة أعلى. وبعد جمع الصور، قم بتحميل سلسلة الصور في برنامج Amira باستخدام وحدة resolve RT. وعند تحميل السلسلة، أدخل أحجام voxel الصحيحة في نافذة معاملات قراءة الصور وانقر موافق.

بعد ذلك، اختر التطبيق الفرعي للعرض متعدد المستويات. ثم استخدم منزلقات العرض الأساسي والسُمك لاختيار سُمك الإسقاط الأمثل وعتبة القيم الرمادية. وأخيراً، استخدم وحدة قص الزاوية لتصفح المقاطع في اتجاهات ثلاثية الأبعاد مختلفة.

لتصور العينات، يعد رسم خريطة للتنظيم الهيكلي للعصبونات أمراً بالغ الأهمية لفهم كيفية عملها في حالتي الصحة والمرض. وبينما يمكن تطبيق التقنيات الثلاث على أعضاء مختلفة، فإنها تكون مفيدة بشكل خاص لتتبع الوصلات العصبونية الطويلة في النخاع الشوكي والدماغ. فعلى سبيل المثال، وباستخدام عمليات مسح مجهرية فائقة لقطع كبيرة مصفاة من النخاع الشوكي، يمكن تتبع الوصلات المحورية عبر سنتيمترات في النخاع الشوكي للقوارض، كما هو موضح في هذه الصور.

وبطريقة مماثلة، يمكن تصوير كامل دماغ الفأر والحصين بعد الشفافية لتتبع الاتصالات العصبية في الدماغ. وعند استخدام المجهر البؤري أو المجهر متعدد الفوتونات، يمكن تحسين دقة التصوير بشكل كبير، خاصة في البعد Z. على سبيل المثال، يحقق التصوير متعدد الفوتونات للنخاع الشوكي المشفف من فئران سلالة GFPM صورة سلسة عبر كامل عمق النخاع الشوكي الذي يتراوح من 1.5 إلى 2 mm.

يوفر المجهر البؤري (Confocal microscopy) على النخاع الشوكي المصفى دقة محسنة بطريقة مماثلة. كما يوفر التصوير بالمجهر متعدد الفوتونات (Multi photon microscopy) للأدمغة المصفاة صوراً ذات دقة عالية جداً لتصور التفاصيل الدقيقة للهياكل العصبية، بما في ذلك الأشواك التغصنية. ويمكن وسم العينات المجهزة بطريقة three disco بأساليب متنوعة.

على سبيل المثال، يمكن وسم كامل الأوعية الدموية في الدماغ والنخاع الشوكي باستخدام متتبعات فلورية مقترنة باللكتين، والتي يمكن استخدامها لدراسة الحاجز الدموي الدماغي في حالتي الصحة والمرض. كما يمكن تصوير الخلايا الأصغر في الأنسجة الكبيرة باستخدام تقنية disco. فعلى سبيل المثال، تلعب كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية دوراً كبيراً في باثولوجيا التحلل العصبي، بما في ذلك مرض الزهايمر والإصابات الرضخية.

باستخدام ثلاث أقراص، يمكن دراسة كثافتها وتوزيعها في النخاع الشوكي. كما يمكن تصوير الأنسجة غير العصبية أيضاً؛ فعلى سبيل المثال، يمكن وسم خلايا Clara في رئتي القوارض بالكامل مناعياً باستخدام الأجسام المضادة وتصويرها دون الحاجة إلى التقطيع على مستوى الخلية الواحدة.

وبالمثل، يمكن إجراء عملية التصفية والتصوير للخلايا في أنسجة البنكرياس غير المصرح بها. على سبيل المثال، تم تصوير خلايا ألفا الموسومة بفلورسنت بعد عملية التصفية في صور البنكرياس هذه. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً هاماً لأنه على الرغم من بساطة خطوات التصفية والتصوير، إلا أن تحليل البيانات قد يكون معقداً.

أثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تصوير الأنسجة الشفافة بمجرد تحقيق الشفافية الكاملة، لأن الإشارة الفلورية ستتدهور بمرور الوقت في محلول الترويق. وقد مهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف التفاصيل والأعضاء السليمة، مثل رسم خرائط الشبكات العصبية في الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ترويق وتصوير البنى الخلوية ودون الخلوية في الأعضاء بأكملها، ومن ثم تصورها وتحليلها.