التداخل الحيوي طبقة لقياس حركية البروتين البروتين التفاعلات والآثار تفارغي يجند

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس حركية البروتين وتفاعلات البروتين والتأثيرات الخيفية للروابط الصغيرة على تلك التفاعلات باستخدام قياس تداخل الطبقة الحيوية ، BLI. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير أحد البروتينات التي تحتوي على بيوتين معين وتثبيته على سطح البكتيريا. أجهزة الاستشعار الحيوية المطلية بعدن بالتوازي.

كخطوة ثانية ، يتعرض البروتين المرتبط بالمستشعر للمخزن المؤقت الذي يحتوي على شريكه الملزم ، ويتم قياس الارتباط في الوقت الفعلي من خلال تأثيره على التداخل البصري على سطح المستشعر. بعد ذلك ، يتم نقل كل مستشعر إلى مخزن مؤقت بدون شريك الربط من أجل قياس تفكك البروتين في الوقت الفعلي. مجمعات البروتين.

تسمح النتائج التي تم الحصول عليها بتحديد ثوابت المعدل الحركي لربط وتفكك البروتينات المتفاعلة وبالتالي تقارب ارتباطها. تظهر النتائج الإضافية أن BLI يمكنه اكتشاف تأثيرات الروابط الصغيرة على معدل تفكك مركب بروتين البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل رنين البلازما السطحية ، هي أن BLI ليس شديد الحساسية لتغيرات معامل الانكسار.

لذلك يمكن أن تتضمن خطوات الربط والارتباط تغييرات في الروابط الصغيرة لاختبار تأثيراتها على تفاعلات البروتين والبروتين في الوقت الفعلي ، على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول حركية تفاعل البروتين والبروتين. يمكن أيضا تطبيقه على مجموعات مختلفة مثل ارتباط البروتين بالحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الثابت أو ارتباط الجسيمات الشحمية ببروتين ثابت ابدأ هذه التجربة بإعداد أداة BLI كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم قم بإعداد التصميم التجريبي في برنامج الحصول على البيانات. حدد تجربة حركية جديدة في علامة تبويب معالج التجربة. يقدم هذا قائمة مبوبة مع جميع الخطوات التي يجب تحديدها في علامة التبويب الأولى.

حدد الأعمدة المراد استخدامها. على لوحة عينة البئر 96. قم بتعيين أعمدة لاحتواء المخزن المؤقت أو البروتين المراد تجميد أو شريك الربط.

لكل جمعية ، أدخل تركيز الشريك الملزمة لاستخدامه. في علامة التبويب الثانية ، حدد جميع الخطوات اللازمة للمقايسة. وتشمل هذه اقتران التحميل الأساسي وتفكيك الشريك الملزم.

ترتبط خطوات الفحص الفردية بأعمدة الآبار على لوحة العينة عن طريق تحديد خطوة الفحص ثم النقر المزدوج على العمود المعني. هذا يبرمج أجهزة الاستشعار المراد نقلها من عمود من الآبار إلى آخر. أثناء الفحص ، ابدأ بخطوة خط أساس موجزة مرتبطة بالعمود الأول من الآبار مع مخزن مؤقت للفحص لإنشاء إشارات BLI أولية في لوحة البئر 96.

ثم اربط خطوة التحميل بالآبار التي ستحتوي على البروتين الحيوي. استخدم وظيفة العتبة لتحقيق مستوى محدد مسبقا من الربط. اضبط خيار العتبة بحيث يتم نقل جميع المستشعرات إلى العمود التالي من الآبار.

عندما يصل أي من أجهزة الاستشعار إلى العتبة ، قم بتضمين خطوة أساسية أخرى في المخزن المؤقت لغسل البروتينات الحيوية غير المجمدة من المستشعرات وإنشاء إشارات أساسية مستقرة جديدة للمقايسات الأساسية لتحديد ثوابت معدل الارتباط والتفكك العالمية تتضمن خطوة أساسية إضافية مع أجهزة استشعار في عمود جديد من الآبار العازلة قبل الارتباط. الخطوة التالية ، اربط الارتباط. خطوة إلى عمود الآبار التي تحتوي على تركيزات متفاوتة من الشريك الملزم.

اضبط وقت الخطوة بحيث يصل تركيز التشبع على الأقل لشريك الربط إلى إشارة ربط التوازن. بالنسبة لخطوة التفكك ، قم بتعيين المستشعرات للعودة إلى العمود الرابع ، وهي نفس الآبار العازلة المستخدمة لخط الأساس الإضافي قبل الارتباط. يمكن تعديل أوقات خطوات الارتباط والانفصال أثناء التجربة إذا كانت المعدلات أبطأ أو أسرع مما كان متوقعا.

في علامة التبويب الثالثة ، حدد المواقع في درج المستشعر التي ستحتوي على مستشعرات مبللة مسبقا للمقايس. تسمح علامة التبويب الرابعة بالمراجعة الرسومية للبرنامج. في علامة التبويب الخامسة ، أدخل التفاصيل الضرورية بما في ذلك موقع ملفات البيانات ودرجة الحرارة المطلوبة.

للتجربة. قم بتبليل المستشعرات المطلية بالستربتافيدين مسبقا لمدة 10 دقائق على الأقل. لإزالة طلاء السكروز الواقي ، قم بإزالة المستشعر الذي يحتوي على رف من درج المستشعر وأدخل لوحة 96 بئر في الجزء السفلي من الدرج مع تحريك أحد أركان اللوحة في شق التوجيه على الدرج.

لاستخدام عمود المستشعرات ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص لكل بئر. في هذا العمود من لوحة البئر 96 ، أعد رف المستشعرات إلى الدرج في الاتجاه الصحيح كما هو محدد أثناء البرمجة ، املأ آبار لوحة العينة بمخزن مؤقت للفحص أو تخفيفات البروتين المناسبة. تجنب إدخال الفقاعات لأنها يمكن أن تسبب ضوضاء في الإشارة الضوئية.

قم بتضمين واحد أو أكثر من الآبار المرجعية التي تحذف إما البروتين الحيوي أو الشريك الملزم. افتح باب الجهاز ولاحظ انبعاث الضوء من ذراع المستشعر. أدخل درج المستشعر على المسرح مع إدخال ألسنة الأدراج في فتحات المرحلة.

أدخل لوحة العينة في حامل اللوحة. تأكد من أن اللوحة مسطحة وفي الاتجاه الصحيح كما هو موضح على حامل اللوحة. أغلق الباب وابدأ الفحص من برنامج الحصول على البيانات.

إذا كانت المستشعرات لا تزال تتطلب ترطيبا مسبقا، فحدد خيار تأخير بدء التجربة. أخيرا ، بمجرد اكتمال كل إعداد العينة وتحميل كل من لوحة العينة ودرج المستشعر في الجهاز ، انقر فوق الزر go لتشغيل الفحص. بعد تشغيل المقايسة ، افتح برنامج تحليل البيانات وقم بتحميل المجلد الذي يحتوي على البيانات.

انقر فوق علامة تبويب المعالجة لرؤية قائمة المعالجة التدريجية والبيانات الحركية الأولية مع تعيين لون مختلف لكل مستشعر ضمن تحديد البيانات. انقر فوق زر تحديد المستشعر على خريطة لوحة العينة. قم بتعيين الآبار لواحد أو اثنين من أجهزة استشعار التحكم كآبار مرجعية في قائمة المعالجة.

تحقق من مربع الطرح وحدد الآبار المرجعية لطرح الإشارة المرجعية من كل إشارة مستشعرات أخرى. محاذاة جميع التتبعات إلى Y يساوي صفرا باستخدام خطوة المحور محاذاة y. ثم حدد خط الأساس كخطوة محاذاة للنطاق الزمني.

أدخل آخر 10 ثوان من هذا الخط الأساسي. سيؤدي النقر داخل خطوة خط الأساس إلى إظهار المحاذاة. بعد ذلك ، حدد مربع التصحيح بين الخطوات لتقليل تحولات الإشارة بين خطوات الاقتران والتفكك.

حدد سطرا لخط الأساس أو التفكك. حدد وظيفة تصفية KY gole في معظم الحالات ، وانقر فوق بيانات المعالجة لمتابعة فحص بيانات العملية النهائية بصريا في اللوحة اليمنى السفلية. لتحليل البيانات ، انقر فوق علامة التبويب التحليل في تحليل البيانات لخطوة التحليل واختيار الاقتران والتفكك.

بالنسبة للطراز ، حدد واحدا لواحد للتركيب اختر عام. للتجميع حسب تحديد اللون ، حدد r max غير مرتبط بالمستشعر للسماح بالتركيب المستقل لاستجابة الإشارة القصوى عند الارتباط المشبع للشريك بالبروتين الثابت. أخيرا ، انقر فوق منحنيات الملاءمة لبدء تحليل الانحدار غير الخطي.

افحص نتائج التركيب ، والتي تتضمن تراكب منحنيات الانحدار مع آثار بيانات المستشعر ، ومخططات بقايا التركيب ، وجدول بقيم وإحصائيات المعلمات المحددة. يتم عرض حركية BLI في الوقت الحقيقي للربط والتفكك هنا. بدأت هذه التجربة بخطوة أساسية مدتها 10 دقائق نظرا لأن المستشعرات كانت مبللة مسبقا ، ولفترة وجيزة فقط ، ثم تم تحميل الإبسيلون البيوتينيل على المستشعرات.

لم يحدث أي تفكك يمكن اكتشافه في إبسيلون خلال جميع الخطوات المتبقية كما يتضح من المنحنى المرجعي ، والذي لم يضاف إليه شريك ملزم. كان المستشعر المرجعي الثاني خاليا من البروتين المعبأ وأظهر ارتباطا منخفضا غير محدد لشريك الربط. تم استخدام تركيزات مختلفة من F1 ناقص الإبسيلون في خطوة الاقتران لأجهزة الاستشعار A إلى F من أجل ملاءمة النتائج عالميا والحصول على أفضل القيم لثابت معدل الارتباط بثابت معدل الارتباط ونتائج ثابت تفكك التوازن KD ، مما ينتج عنه آثار البيانات الزرقاء.

في هذه الحالة ، تم طرح تتبع المستشعر المرجعي من آثار العينة لتصحيح الارتباط غير المحدد لشريك الربط وانحراف إشارة النظام. في خطوة تحليل البيانات ، كانت جميع المنحنيات مناسبة عالميا مع نموذج واحد لواحد ، واحد لواحد. يفترض الملاءمة العالمية التفكيك التام للشريك الملزم.

تظهر هنا تجربة مختلفة تم فيها ربط الإنزيم بجهاز استشعار إبسيلون ثابت في وجود ملليمولار واحد ، A-T-P-A-D-T-A. هذا يهيئ معظم مجمعات إبسيلون F1 لافتراض التأكيد غير المثبط ، والذي ينفصل بسهولة ، ثم تم نقل المستشعرات إلى آبار التفكك التي تحتوي على عازلة للفحص مع روابط مختلفة. يوضح هذا تأثيرات الروابط المختلفة على تأكيد الإبسيلون.

على سبيل المثال ، أدى التعرض للمغنيسيوم A GP والفوسفات إلى إبطاء صافي التفكك بشكل كبير مما يشير إلى أن الإبسيلون حول التأكيد إلى الحالة المثبطة المرتبطة بإحكام. عند إعداد فحوصات BLI لأول مرة ، من المهم تضمين عناصر تحكم لاختبار الارتباط غير المحدد للبروتين بأجهزة الاستشعار وما إذا كان الارتباط غير المحدد يختلف اختلافا كبيرا مع تركيزات البروتين المراد استخدامها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم برنامج وتحليل فحوصات BLI لقياس حركية تفاعلات بروتين البروتين وتقدير ذلك.

يسمح BLI بإجراء اختبار مباشر لتأثيرات الروابط الصغيرة على تفاعلات بروتين البروتين.