التداخل الحيوي طبقة لقياس حركية البروتين البروتين التفاعلات والآثار تفارغي يجند

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس حركية البروتين، والتفاعلات البروتينية-البروتينية، والتأثيرات التفراغية (allosteric effects) للربائط الصغيرة على تلك التفاعلات باستخدام قياس تداخل الطبقات الحيوية (BLI). ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير أحد البروتينات باستخدام بيوتين محدد وتثبيته على سطح مستشعرات حيوية مطلية بالستريبتادين (strep. Aden) على التوازي.

كخطوة ثانية، يتم تعريض البروتين المرتبط بالمستشعر إلى محلول منظم يحتوي على الشريك الرابط، ويُقاس الارتباط في الوقت الفعلي من خلال تأثيره على التداخل البصري عند سطح المستشعر. بعد ذلك، يُنقل كل مستشعر إلى محلول منظم خالٍ من الشريك الرابط لقياس تفكك البروتين في الوقت الفعلي. المعقدات البروتينية.

تسمح النتائج التي تم الحصول عليها بتحديد ثوابت معدل الحركية للارتباط والتفكك للبروتينات المتفاعلة، وبالتالي تحديد ألفة ارتباطها. وتظهر نتائج إضافية أن تقنية تداخل الليزر الحيوي (BLI) يمكنها الكشف عن تأثيرات الربيطات الصغيرة على معدل تفكك معقد بروتين-بروتين. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل رنين البلازمون السطحي في أن تقنية BLI ليست حساسة بشكل مفرط للتغيرات في معامل الانكسار.

لذا، يمكن أن تتضمن خطوات الربط والارتباط تغييرات في الربائط الصغيرة لاختبار تأثيراتها على التفاعلات بين البروتينات في الوقت الفعلي. ومع ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول حركية التفاعل بين البروتينات. كما يمكن تطبيقها على تركيبات مختلفة مثل ارتباط البروتين بـ DNA أو RNA مثبت، أو ارتباط الليبوزوم ببروتين مثبت. ابدأ هذه التجربة بضبط جهاز BLI كما هو موضح في البروتوكول النصي.

بعد ذلك، قم بإعداد التصميم التجريبي في برنامج الحصول على البيانات. اختر "تجربة حركية جديدة" (new kinetics experiment) في علامة تبويب معالج التجارب. سيعرض هذا قائمة مبوبة تحتوي على جميع الخطوات التي يجب تحديدها في علامة التبويب الأولى.

حدد الأعمدة التي سيتم استخدامها في لوحة عينات ذات 96 بئراً. خصص الأعمدة التي ستحتوي على المحلول المنظم، أو البروتين المراد تثبيته، أو الشريك الرابط.

لكل ارتباط، أدخل تركيز شريك الارتباط المراد استخدامه. في علامة التبويب الثانية، حدد جميع الخطوات اللازمة للمقايسة، والتي تشمل التحميل المرجعي، والارتباط، وانفصال شريك الارتباط.

يتم ربط خطوات المقايسة الفردية بأعمدة الآبار في لوحة العينات عن طريق اختيار خطوة المقايسة ثم النقر المزدوج على العمود المعني. يقوم هذا الإجراء ببرمجة المستشعرات للانتقال من عمود آبار إلى العمود التالي. خلال المقايسة، ابدأ بخطوة خط أساس قصيرة مرتبطة بالعمود الأول من الآبار باستخدام محلول المقايسة المنظم (assay buffer) لتحديد إشارات BLI الأولية في لوحة الـ 96 بئر.

بعد ذلك، قم بربط خطوة التحميل بالآبار التي ستحتوي على البروتين المبيوتن (biotinylated protein). استخدم دالة العتبة (threshold function) لتحقيق مستوى ربط محدد مسبقاً. اضبط خيار العتبة بحيث يتم نقل جميع المستشعرات إلى العمود التالي من الآبار.

عندما يصل أي من المستشعرات إلى العتبة، قم بتضمين خطوة أساسية أخرى في محلول منظم لغسل البروتينات المبيوتنة غير المثبتة من المستشعرات وتأسيس إشارات خط أساس مستقرة جديدة. بالنسبة للمقاييس الأساسية لتحديد ثوابت معدل الارتباط والتفكك العام، قم بتضمين خطوة أساسية إضافية مع وضع المستشعرات في عمود جديد من آبار المحلول المنظم قبل مرحلة الارتباط. بعد ذلك، قم بربط خطوة الارتباط بعمود الآبار التي تحتوي على تركيزات متفاوتة من الشريك الرابط.

قم بضبط زمن الخطوة بحيث يصل تركيز مشبع على الأقل من الشريك الرابط إلى إشارة ربط متوازنة. بالنسبة لخطوة التفكك، حدد المستشعرات للعودة إلى العمود الرابع، وهي نفس آبار المحلول المنظم المستخدمة لخط الأساس الإضافي قبل الارتباط. يمكن تعديل أزمنة خطوات الارتباط والتفكك أثناء التجربة إذا كانت المعدلات أبطأ أو أسرع مما كان متوقعاً.

في علامة التبويب الثالثة، حدد المواقع في صينية المستشعرات التي ستحتوي على مستشعرات مبللة مسبقاً من أجل المقايسة. تتيح علامة التبويب الرابعة المراجعة الرسومية للبرنامج. وفي علامة التبويب الخامسة، أدخل التفاصيل اللازمة بما في ذلك موقع ملفات البيانات ودرجة الحرارة المطلوبة.

من أجل التجربة، قم بترطيب المستشعرات المطلية بالستريبتاديفين مسبقاً لمدة 10 دقائق على الأقل. ولإزالة طبقة السكروز الواقية، أخرج الرف الذي يحتوي على المستشعرات من صينية المستشعرات وأدخل طبقاً من نوع 96 بئراً في قاع الصينية، مع إزاحة أحد أركان الطبق داخل شق التوجيه الموجود في الصينية.

بالنسبة لعمود المستشعرات المراد استخدامه، أضف 200 µL من بافر المقايسة في كل بئر. في هذا العمود من طبق الـ 96 بئراً، أعد حامل المستشعرات إلى الصينية بالاتجاه الصحيح كما تم تعيينه أثناء البرمجة، ثم املأ آبار طبق العينات ببافر المقايسة أو تخفيفات البروتين المناسبة. تجنب تكوين فقاعات حيث يمكن أن تسبب ضوضاء في الإشارة الضوئية.

قم بتضمين بئر مرجعي واحد أو أكثر يتم فيه حذف إما البروتين المُرتبط بالبيوتين أو الشريك الرابط. افتح باب الجهاز ولاحظ المخرج الضوئي من ذراع المستشعر. أدخل درج المستشعر على المنصة مع إدخال ألسنة الدرج في فتحات المنصة.

ضع لوحة العينة في حامل اللوحات. تأكد من استواء اللوحة ووضعها في الاتجاه الصحيح كما هو موضح على حامل اللوحات. أغلق الباب وابدأ المقايسة من برنامج الحصول على البيانات.

إذا كانت المستشعرات لا تزال تتطلب ترطيباً مسبقاً، فاختر خيار تأخير بدء التجربة. وأخيراً، بمجرد اكتمال جميع عمليات تحضير العينة وتحميل كل من لوحة العينات وصينية المستشعرات في الجهاز، انقر فوق زر البدء (go) لتشغيل المقايسة. بعد تشغيل المقايسة، افتح برنامج تحليل البيانات وحمّل المجلد الذي يحتوي على البيانات.

انقر فوق علامة تبويب المعالجة لرؤية قائمة معالجة خطوة بخطوة والبيانات الحركية الخام مع تخصيص لون مختلف لكل مستشعر ضمن تحديد البيانات. انقر فوق زر اختيار المستشعر في خريطة لوحة العينة. حدد الآبار الخاصة بمستشعر تحكم واحد أو اثنين كآبار مرجعية في قائمة المعالجة.

قم بتفعيل مربع "الطرح" (subtraction) واختيار الآبار المرجعية لطرح الإشارة المرجعية من إشارة كل مستشعر آخر. قم بمحاذاة جميع المسارات عند القيمة Y تساوي صفر باستخدام خطوة محاذاة المحور Y. بعد ذلك، اختر "خط الأساس" (baseline) كخطوة محاذاة للنطاق الزمني.

أدخل الثواني العشر الأخيرة من ذلك الخط القاعدي. سيؤدي النقر داخل خطوة الخط القاعدي هذه إلى إظهار المحاذاة. بعد ذلك، حدد مربع تصحيح ما بين الخطوات لتقليل إزاحات الإشارة بين خطوتي الارتباط والانفصال.

اختر خطاً أساسياً أو تفككاً. اختر وظيفة تصفية KY gole في معظم الحالات، وانقر على معالجة البيانات للمتابعة؛ ثم افحص بصرياً بيانات العملية النهائية في اللوحة السفلية اليمنى. لتحليل البيانات، انقر فوق علامة تبويب التحليل في تحليل البيانات لتحديد الخطوة المراد تحليلها، ثم اختر الارتباط والتفكك.

بالنسبة للنموذج، اختر "واحد إلى واحد" (one to one) للملاءمة، ثم اختر "عالمي" (global). وفيما يخص "التجميع حسب" (group by)، اختر "اللون" (color)، واختر "R max غير مرتبط بالمستشعر" (r max unlinked by sensor) للسماح بملاءمة مستقلة للاستجابة القصوى للإشارة عند التشبع الارتباطي للشريك بالبروتين المثبت. وأخيرًا، انقر فوق "ملاءمة المنحنيات" (fit curves) لبدء تحليل الانحدار غير الخطي.

افحص نتائج المطابقة، والتي تتضمن تراكب منحنيات الانحدار مع آثار بيانات المستشعر، ومخططات البواقي للمطابقة، وجدولاً يحتوي على قيم المعلمات المحددة والإحصائيات. تظهر هنا حركية الارتباط والتفكك في الوقت الفعلي باستخدام تقنية التداخل البيومترِي (BLI). بدأت هذه التجربة بخطوة أساس مرجعية لمدة 10 دقائق نظراً لأن المستشعرات قد تم ترطيبها مسبقاً لفترة وجيزة، ثم تم تحميل epsilon المبيوتني (biotinylated epsilon) على المستشعرات.

لم يحدث تفكك ملحوظ لـ epsilon طوال الخطوات المتبقية كما ظهر من منحنى المرجع، الذي لم تتم إضافة شريك ربط إليه. وكان مستشعر مرجعي ثانٍ خالياً من البروتين المعبأ وأظهر ربطاً غير نوعي منخفضاً لشريك الربط. استُخدمت تركيزات مختلفة من F1 ناقص epsilon في خطوة الارتباط للمستشعرات من A إلى F من أجل ملاءمة النتائج عالمياً والحصول على أفضل قيم لثابت معدل الارتباط وثابت التفكك المتوازن KD؛ وقد تمت معالجة النتائج، مما أنتج آثار البيانات الزرقاء.

في هذه الحالة، تم طرح أثر المستشعر المرجعي من آثار العينة لتصحيح الارتباط غير النوعي للشريك الرابط وانزياح إشارة النظام. وفي خطوة تحليل البيانات، تم عمل ملاءمة عالمية لجميع المنحنيات باستخدام نموذج ارتباط واحد لواحد (one-to-one). وتفترض الملاءمة العالمية التفكك الكامل للشريك الرابط.

تُعرض هنا تجربة مختلفة تم فيها ربط الإنزيم ببروتين epsilon المثبت على المستشعر بوجود 1 mM من A-T-P-A-D-T-A. وهذا يجعل معظم معقدات F1 epsilon مهيأة لاتخاذ الهيئة غير المثبطة، والتي تتفكك بسهولة؛ ثم نُقلت المستشعرات بعد ذلك إلى آبار التفكك التي تحتوي على منظم المقايسة مع ربيطات مختلفة. ويوضح هذا تأثيرات الربيطات المختلفة على هيئة epsilon.

على سبيل المثال، أدى التعرض إلى magnesium A GP والفوسفات إلى إبطاء صافي التفكك بشكل كبير، مما يشير إلى أن epsilon قد غير شكلها البنيوي إلى الحالة التثبيطية شديدة الارتباط. عند إعداد فحوصات BLI لأول مرة، من المهم تضمين ضوابط لاختبار الارتباط غير النوعي للبروتين بالمستشعرات، وما إذا كان الارتباط غير النوعي يختلف بشكل كبير مع تركيزات البروتين المستخدمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وبرمجة وتحليل فحوصات BLI لقياس حركية التفاعلات بين البروتينات والبروتينات وتقدير ذلك.

يتيح قياس تداخل الليزر الحيوي (BLI) إجراء اختبار مباشر لتحديد تأثيرات اللجينات الصغيرة على التفاعلات البروتينية البروتينية.