نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية

الهدف العام من هذا الفيديو هو توضيح الإجراء من تخليق فوسفات النيوكليوزيد المعدل إلى توصيفها الكيميائي الحيوي الكامل. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحويل سلائف النيوكليوزيد المحمية بشكل مناسب أولا إلى الفوسفات الثلاثي المقابل عن طريق تطبيق إجراء وعاء واحد من أربع خطوة. الخطوة الثانية هي تنقية الفوسفات الثلاثي الناتج أولا عن طريق الترسيب ثم عن طريق الطور العكسي للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء.

بعد ذلك ، يتميز تناظري الفوسفات الثلاثي بالرنين المغناطيسي النووي ووقت تأين الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة للرحلة أو الرنين المغناطيسي النووي و maloff لضمان نقاء عالي. الخطوة الأخيرة هي تفاعلات التمديد التمهيدي وتفاعلات بلمرة النوكليوتيدات الديوكسي الطرفية أو تفاعلات بلمرة TDT. في النهاية ، يتم تحليل منتجات التفاعل ، وبالتالي قبول الركيزة للفوسفات الثلاثي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.

تتمثل ميزة هذه الطريقة مقارنة بالاستراتيجيات التركيبية الأخرى مثل نهج Borge في أنه يتم تشكيل عدد أقل من المنتجات الجانبية ، وبالتالي يكون التنقية أسهل. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنها إجراء طويل ومعقد يتطلب معرفة في مجالات متعددة. خطرت لنا فكرة تصوير هذه الطريقة لأول مرة عندما قمنا بتصنيع الفوسفات المعدل ووجدنا أنه من الصعب العثور على إجراء مفصل.

ميزة أخرى لهذه الطريقة هي أنه يمكن استخدامها لمعالجة أسئلة أخرى في مجال الأحماض النووية المعدلة. في الواقع ، يمكن استخدامه لاختيار إنزيمات الحمض النووي التي تحفز مجموعة واسعة من التفاعلات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة للوضع الوظيفي على الأحماض النووية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التوليف والتنقية لأن الفوسفات الثلاثي عبارة عن مشتقات قطبية ومنشطة يجب التعامل معها بعناية. للبدء ، تبخر النيوكليوزيد المحمي بالهيدروكسيل ثلاثي الرئيسيات مرتين مع ملليلترين من البيورين اللامائي قبل التجفيف تحت الفراغ طوال الليل. في الوقت نفسه ، قام بيروفوسفات الأمونيوم الجاف تحت الفراغ طوال الليل في اليوم التالي بإذابة النيوكليوزيد في ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من البيريدين الجاف.

ثم أضف 400 ميكرولتر من الديوكسان الجاف كمذيب COS. أخيرا ، أضف الفوسفور الدوري ثلاثة مشتقات واتركه يتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول بيروفوسفات الأمونيوم الجاف بوتيل في 170 ميكرولتر من ثنائي ميثيل فورماميد الجاف و 58 ميكرولتر من أمين ثلاثي بوتيل المقطر حديثا.

أضف المحلول الناتج إلى خليط التفاعل واتركه يتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. ثم قم بإعداد محلول من 160 ميكرومولار من اليود في 980 ميكرولتر من البيورين و 20 ميكرولتر من الماء. أضف المحلول إلى خليط التفاعل.

من أجل أكسدة مركز ألفا الفوسفور. اترك المحلول المظلم الناتج يقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. استخدم محلول مائي بنسبة 10٪ من كبريتات ثيو الصوديوم لإرواء اليود الزائد.

قم بإزالة المذيب تحت الفراغ. ثم أضف خمسة ملليلتر من الماء واترك الخليط يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتحلل غدة الفوسفات الثلاثي الدورية. في هذه المرحلة ، عادة ما تتم إزالة مجموعات الحماية.

وبالتالي ، أضف 30٪ هيدروكسيد إيموديوم إلى العينة الخام. يقلب لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة المذيب تحت الفراغ. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من الماء وقسم الخليط إلى أنابيب أنبوبية.

أضف 12 مل من محلول 2٪ من الصوديوم لكل كلورات في الأسيتون وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة قبل تكرار الإجراء. مرة إضافية. سوف تترسب الكواشف المستخدمة في التخليق من الفوسفات الثلاثي لتشكيل بقايا زيتية وتسمح بفصل المذيبات ، وبالتالي تبسيط تنقية HPLC ذات المرحلة العكسية التي تلت ذلك بشكل كبير بعد تجفيف الهواء للمخلفات الزيتية.

سجل طيف P 31 NMR للعينة الخام وفقا للإجراءات القياسية. بعد الرنين المغناطيسي النووي ، أذاب البقايا الزيتية في أربعة ملليلتر من الماء المقطر. ابدأ تنقية HPLC بتحضير 50 مللي مولار ثلاثي إيثيل الأمونيوم بيكربونات في الماء فائق النقاء مثل EENT A وفي 50٪ أسيتيل النتريل مثل eent B كما هو مفصل في بروتوكول النص ، Degas على حد سواء EENT تحت الفراغ والتحريك لمدة 20 دقيقة.

قم بإعداد عينة تحليلية عن طريق إذابة 10 ميكرولتر من الفوسفات الثلاثي الخام في 300 ميكرولتر من الماء المقطر. ثم استخدام تدرج يتراوح من 0٪ B إلى 100٪ B في 40 دقيقة. حقن العينة في نظام HPLC المجهز بعمود المرحلة العكسية C 18 شبه التحضيري.

اضبط برنامج HPLC وفقا لوقت الاحتفاظ بثلاثي الفوسفات وثنائي الفوسفات. قم بتنقية الخليط الخام باستخدام هذه الظروف وعن طريق إزالة الكسور المبكرة التي قد تحتوي على بعض ثنائي الفوسفات ، امزج جميع الكسور التي تحتوي على المنتج وقم بتجميدها حتى تجف. ثم يتبخر المشترك عدة مرات بالماء عالي النقاء.

تقييم نقاء الفوسفات الثلاثي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي والمالوف من خلال تطبيق البروتوكولات القياسية. تقع الغلة النموذجية التي تم الحصول عليها من خلال تطبيق هذا البروتوكول في حدود 30 إلى 70٪ اعتمادا على الركيزة لخمسة أوليات ووضع العلامات على التمهيدي. امزج التمهيدي والكواشف كما هو مفصل في بروتوكول النص واحتضان تفاعل الملصقات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

أثناء تفاعل وضع العلامات ، قم بإعداد عمود ماصة G 10 عن طريق توصيل طرف ماصة سعة مليلتر واحد بالصوف الزجاجي المنعزل وملء الطرف بمحلول G 10. قم بالدوران والغسل ثلاث مرات ب 500 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج وغسل أخير ب 50 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. بعد حضانة تفاعل الملصقات ، قم بتعطيل الحرارة الكيناز لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتشغيل خليط التفاعل عبر G 10. لإزالة هلام الملصق المشع الحر ، قم بتنقية التمهيدي المسمى بالراديو واستعاده عن طريق تطبيق طريقة التكسير والنقع ، ويرسب الإيثانول و G 10 يحلى قليل النوكليوتيد المراوغ. بالنسبة لتفاعل التمديد التمهيدي ، اجمع بين مول PICA واحد من التمهيدي المليء بالإشعاع ، P واحد 10 مولات PICA من التمهيدي ، P واحد و 10 مولات PICA من القالب ، T واحد في 10 × عازلة التفاعل والركوع في الماء الساخن.

ثم تبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة على مدار 45 دقيقة. ضع الأنبوب على الجليد وأضف فوسفات النيوكليوزيد أو كوكتيل DNTP ووحدة واحدة من ثلج بوليميراز الحمض النووي. أكمل التفاعل بالماء للحصول على حجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر يحتضن عند درجة حرارة العمل المثلى للإنزيم.

ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول التوقف وقم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بارد ، العينات تنخفض عند صفر درجة مئوية. قبل الحل عن طريق تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.

تصور النطاقات بواسطة جهاز تصوير الفوسفو لبلمرة TDT ، وتخفيف التمهيدي المفرد الذي تقطعت به السبل غير المسمى P two والتمهيدي المسمى بالراديو في ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت TDT. ضع الأنبوب على الثلج وأضف كوكتيل DNTP وبوليميراز TDT ثم احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول التوقف قبل تسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم تبرد عند صفر درجة مئوية.

بعد حل العينة عن طريق تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ، تصور العصابات باستخدام جهاز تصوير الفوسفو. يظهر هنا طيف نموذجي من P 31 NMR الخام ل DNTP المعدل حيث يمكن ملاحظة الإشارات المميزة لمراكز الفوسفور. بالإضافة إلى ذلك ، الإشارات الناشئة عن جانب ثنائي الفوسفات والأحادي الفوسفات.

دائما ملاحظة المنتجات جنبا إلى جنب مع الفوسفات العالي في هذه المرحلة. يظهر تحليل HPLC للطور العكسي للخليط الخام هنا. تتوافق الذروة الرئيسية مع الفوسفات الخمسة الأولية ، في حين أن المنتج الثانوي الرئيسي ، ثنائي الفوسفات الخمسة الرئيسي يعرض وقت احتفاظ أقل قليلا.

أخيرا ، بعد مرحلة عكسية شاملة ، تنقية HPLC ، يتميز DNTP المعدل بالرنين المغناطيسي النووي و maldi الموضح هنا هو طيف maloff من سلفا ide ، نظير DUTP المعدل. يمكن رؤية مقرب الصوديوم عند زيادة الكتلة 712.54 ، ولا يوجد أي أثر لثنائي الفوسفات. يعد كل من أطياف P 31 NMR و Proton NMR ضرورية لتقييم نقاء dps المعدلة.

نظرا لأن وجود صبغة غير مرغوب فيها وفوسفات أحادي يعطي إشارات مميزة موضحة ، فإليك نتيجة تفاعلات التمديد الأولية مع DUTP المعدل بالهيستامين المعدل عبر البرولين و DCTP المعدل بحمض الاليريك المستخدم إما كتعديلات وحيدة كمجموعات من اثنين من DN dps المعدلة أو معا ، جنبا إلى جنب مع DGTP طبيعي وحيد. أخيرا ، تم تحليل تفاعلات البلمرة بوساطة TDT التمثيلية مع نظائر DUTP المعدلة المختلفة باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد. في هذا السياق ، تعد DUTP المعدلة بالبرولين المستقلة و DUTP المعدلة بالببتيد أفضل ركائز ل TDT.

نظرا لأن كفاءات المخلفات قابلة للمقارنة أو تتجاوز تلك الخاصة ب DTTP الطبيعي بدلا من ذلك ، فإن DUTP المعدل باليوريا هو ركيزة ضعيفة إلى حد ما في هذا السياق. نظرا لأن القليل من تشتت بولي ، يمكن ملاحظة قليل النوكليوتيدات ذات الحجم الأطول بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوع واحد تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن الفوسفات السيتريك النووي هو اللبنات الأساسية المنشطة للطبيعة ، وبالتالي يجب توخي الحذر أثناء التعامل معها بعد إنشائها.

يستخدم الباحثون في مجال الأحماض النووية هذه الطريقة لاستكشاف الاختيارات الاندماجية لتوليد الأحماض النووية المعدلة والأحماض النووية التحفيزية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتوصيف الفوسفات المعدل باستخدام إجراء البوب المكون من أربع خطوات ، متبوعا بتنقية HPLC في المرحلة العكسية وتفاعلات التمديد الأولية. ستظهر بعض التفاصيل التجريبية التي لا توجد عادة في الأقسام التجريبية.

يمكن استخدام هذه الطريقة مع تقنيات أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل للإجابة على أسئلة إضافية. في الواقع ، يمكن استخدامه لتقييم توافق الفوسفات الثلاثي المعدل مع طرق اختيار VIO.