و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على معقدات بروتينية من أجنة ذبابة الفاكهة (drosophila) الحية باستخدام نهج الربط التشابكي في الجسم الحي (in vivo cross-linking). ويتحقق ذلك أولاً عن طريق وضع آلاف الذباب في قفص تربية وجمع الأجنة المبكرة. بعد ذلك، يتم إجراء الربط التشابكي للبروتينات في الجسم الحي باستخدام الفورمالديھيد، مما يعمل على استقرار معقداتها البروتينية الداخلية.

بعد ذلك، يتم تحضير مستخلصات بروتينية من الأجنة المترابطة لتمكين الترسيب المناعي للمعقدات البروتينية. وتحدد النتائج المعقدات البروتينية المعزولة عن طريق تحليل لطخة ويسترن. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل العزل التقليدي للمعقدات البروتينية باستخدام منهجيات في المختبر (in vitro)، في أن هذا النهج داخل الكائن الحي (in vivo) يتيح لنا رصد التفاعلات البروتينية-البروتينية العابرة ولكن ذات الأهمية الوظيفية، والتي قد لا يتم اكتشافها باستخدام الطرق التقليدية في المختبر.

سوف تقوم الدكتورة Min Gao، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري، باستعراض هذه التقنية. أولاً، اخلط الماء وأجار الذباب باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. ثم قم بمعالجة هذا الخليط في جهاز التعقيم (Autoclave) خلال دورة التعقيم.

امزج السكروز مع عصير التفاح وسخنه إلى 70 درجة مئوية على لوح تسخين. لاحقاً، ادمج المزيجين واتركهما ليبردا لمدة 15 دقيقة قبل أن يتصلب الآجار. قم بتحضير ميثيل رباعي هيدروكسي بنزوات طازج في الإيثانول.

هذه هي المادة الحافظة. أضفها إلى خليط التصلب وحركها لمدة خمس دقائق. ثم صب الخليط في أطباق بلاستيكية أو من البوليستيرول بمساحة 300 square centimeter دون تكوين فقاعات.

تُحفظ الأطباق عند درجة حرارة 4 °C وتُستخدم خلال أسبوع واحد. جهز قفص تجميغ يحتوي على 40 إلى 50,000 ذبابة لجمع الأجنة منها. ثبت طبقين جديدين من وسط دقيق الذرة والدبس، مع رش حوالي 4 g من خميرة الخباز على السطح، داخل قفص التجميع.

اترك الذباب ليعيش على هذه الأطباق لمدة 48 ساعة عند 25 درجة مئوية. وبعد يومين، رش حوالي جرام واحد من الخميرة على طبقين من آجار عصير التفاح، واستبدل الأطباق الموجودة في قفص المجموعة بهذه الأطباق. وبعد مرور ساعة، استبدل الأطباق الموجودة في القفص بطبقين آخرين من نفس النوع.

سيتم تحميل الأجنة من لوحي الجمع اللذين استخدمتهما الذباب لمدة ساعة واحدة. قم بتعليق الأجنة والماء على اللوح واستخدم فرشاة للمساعدة في إزالتها، ثم اسكبها من خلال منخل مكون من طبقتين.

تتكون الطبقة العلوية من شبكة فولاذية بقطر مسام 850 micron، بينما تتكون الطبقة السفلية من شبكة فولاذية بقطر مسام 75 micron. ستتجمع الأجنة على الشبكة الأكثر دقة، ويتم فصلها عن الحطام الخشن باستخدام فرشاة رسم. انقل الأجنة إلى سلة ذات شبكة نايلون دقيقة مصنوعة من الجزء العلوي لأنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

اشطف الأجنة بالماء وجففها داخل الشبكة عن طريق ضغطها على منشفة ورقية. بعد ذلك، اغمر الأجنة في محلول مبيض بتركيز 50% لمدة ثلاث دقائق. قم بتحريك الأجنة في المبيض، ثم اشطفها جيداً بالماء وجففها عن طريق التربيت.

تُغمر الأجنة بعد ذلك في الإيزوبروبانول لمدة 15 ثانية تقريبًا. ويؤدي التحريك الدائري إلى تفكيك تكتلات الأجنة، ولا ينبغي أن تستغرق هذه العملية أكثر من 30 ثانية. تُجفف الأجنة عن طريق التربيت عليها، ثم تُنقل إلى محلول الهيبتان لمدة خمس دقائق.

قم بماصّة الهبتان فوق الأجنة بشكل متكرر لمنع تكتلها، ثم جفف الأجنة بالتربيت واغسلها في محلول PBST. بعد غسل الأجنة لمدة ثلاث دقائق، انقلها على الشبكة إلى أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على 10 milliliters من محلول PBST. أزل الشبكة مع ترك الأجنة في المحلول، واحرص على أن تكون كمية الأجنة ما بين 100 و300 microliters.

اترك العينات حتى تترسب في القاع، ثم اسحب محلول PBST وابدأ فوراً في عملية الربط التشابكي لربط الأجنة تشابكياً. أولاً، أضف 10 milliliters من محلول formaldehyde بتركيز 0.2% المحضر حديثاً في PBST إلى الأجنة. ثم اتركها لتحتضن مع تقليب خفيف عند درجة حرارة 25 degrees Celsius لمدة 10 minutes.

بعد مرور 10 دقائق من التفاعل، اترك الأجنة تترسب ثم قم بإزالة المحلول. بعد ذلك، استبدل المحلول بسرعة بـ 10 milliliters من glycine بتركيز 0.25 molar في PBST لإيقاف التفاعل. اضبط الأنبوب للرج لمدة خمس دقائق أخرى. بعد إيقاف التفاعل، قم بإزالة المحلول وشطف الأجنة ثلاث مرات باستخدام 10 milliliters من PBST في كل عملية شطف.

قم بإزالة ما تبقى من PBST عن طريق الشفط بالماصة، واحفظ الأجنة في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يحين وقت استخدامها. وباستخدام جهاز التجانس (homogenizer) و2 mL من محلول التحلل (lysis buffer)، قم بتجنيس 500 µL من الأجنة المترابطة. وتتطلب هذه العملية حوالي 15 ضربة باستخدام مدقة محكمة.

انقل المستخلص إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واضبطه ليهتز بلطف لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بطرد المستخلص مركزياً عند 16,000 GS لمدة خمس دقائق. ثم انقل supernatant إلى أنبوب سعة 15 milliliter.

يمكن التخلص من الراسب. الآن، أضف 40 µL من ملاط خرزات anti ha agros إلى الراشح. اضبط جهاز الهزاز لمدة 2.5 ساعة تقريباً حتى يكتمل اقتران الخرزات.

قم بترسيب الخرز عن طريق الطرد المركزي بقوة 2,500 Gs لمدة خمس دقائق. اترك حوالي 250 microliters من السائل الطافي في الأنبوب وأعد تعليق الخرز فيه. انقل الخرز المعلق إلى مرشح بمسامية 10 micron على عمود طرد مركزي.

قم بإزالة المحلول عن طريق تدوير العينة لمدة عشر ثوانٍ عند 12,000 Gs. اغسل الحبيبات الموجودة في العمود باستخدام 200 µL من محلول الغسيل مع تدويرها مرة أخرى. كرر هذه العملية ثلاث مرات إجمالاً. ثم أضف 40 µL من محلول الاستخلاص إلى الحبيبات واحضنها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة.

رجّ الأنبوب بلطف كل خمس دقائق خلال هذه الفترة لجمع الرواسب. قم بطرد العمود مركزيًا مرة أخرى عند 12,000 GS لمدة 10 ثوانٍ. تم تحليل فعالية الربط التشابكي وتنقية معقدات البروتين الثنائية المترابطة تشابكيًا بواسطة SDS page على هلام متدرج بنسبة 3 إلى 7% متبوعًا بـ western blot. استُخدمت أجنة تعبر عن HA tag وGFP protein لمراقبة مدى الربط التشابكي واختبار تركيزات مختلفة من الفورمالدهيد للبروتوكول.

لم يقم معظم بروتين GFP في الأجنة المعالجة بالارتباط التشابكي، لذا لم يحدث ذلك. وتمت مقارنة معقدين مرتبطان تشابكياً بشكل عشوائي مع مجموعة ضابطة غير مرتبطة تشابكياً. ويظهر البروتينان اللذان لم يرتبطا تشابكياً عند حزمة 285 kilodalton التي تهاجر بحرية.

يكون البروتين المترابط عرضياً (Cross-linked) الثاني أثقل وزناً وأقل هجرة في تحليل البروتينات الخام. وقد تمت عملية الربط العرضي لنحو نصف كمية البروتين الثاني مع شركائه المتفاعلين في الجسم الحي (in vivo). وبالمقارنة، أظهر الشطف باستخدام ببتيد HA وجود كل من البروتين المرتبط في معقد والبروتين الحر في جزء الشطف، وذلك بعد غسل الحبيبات.

مع إزالة SDS، يصبح الأنبوب خالياً في الغالب مع وجود حد أدنى من المعقد الأنبوبي. وباتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مطيافية الكتلة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بطرق مثل تحديد مكونات البروتين في المعقدات المعزولة.