والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام القصبة الهوائية الفموية والبلعومية وإدارة LPS والغسل القصبي الهوائي لتقييم الاستجابة المناعية للمضيف في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح الفأر أولا ب LPS باستخدام إعطاء الفم والبلعوم. في الخطوة الثانية ، يتم إدخال قنية القصبة الهوائية في سائل غسيل القصبات الهوائية ، أو يتم جمعها بعد ذلك من خلال القنية لتقييم الاستجابة الالتهابية المحلية.

في الخطوة الأخيرة ، يتم نفخ الرئتين بالفورمالين للتقييم النسيجي المرضي. في النهاية ، يمكن تحليل ملف تعريف السيتوكين في الأمعاء وعلم الأنسجة المرضي للرئة لتقييم الاستجابة المناعية للمضيف ل LPS. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الإدارة داخل الأنف والإدارة الجراحية داخل القصبة الهوائية ، هي أن هذه التقنية سهلة الأداء نسبيا وتسمح بالجرعات الدقيقة وترسب الرئة.

عن طريق القصبة الهوائية ، قم بحقن LPS أولا. تعليق فأر مخدر عند التنبيب. قف بجانب القواطع الأمامية ، مع التأكد من تقييد بشكل آمن وإمكانية الوصول إلى الفم واللسان.

قم بتأمين اللسان برفق باستخدام ملقط مستقيم ، ثم أمسك اللسان بالملقط المائل واسحب العضلة برفق من الفم حتى تشعر بمقاومة طفيفة أثناء الإمساك باللسان. في هذا الوضع ، قم بإعطاء جرعة 50 ميكرولتر من LPS في مؤخرة الحلق وقم بتغطية أنف على الفور بإصبع مرتديا قفازا لمدة خمسة إلى 10 أنفاس لجمع الحمام بعد التضحية. بعد ذلك ، قم بعمل شق أفقي عبر طول التجويف البريتوني وشق رأسي من التجويف البريتوني إلى الفك السفلي للفأر.

ثم أمسك جانبي الشق بالملقط واسحب الجلد برفق بعيدا عن التجاويف البريتونية والصدرية الأساسية. بعد ذلك ، قم بعمل شق كبير على طول التجويف البريتوني من الأعضاء التناسلية إلى القص ، مع الحرص على تجنب قطع الحجاب الحاجز. ثم قم بتحريك الأمعاء برفق داخل التجويف البريتوني للسماح بالوصول إلى إحدى الكلى.

قطع الوريد الكلوي المؤدي إلى الكلى ليكون بمثابة نقطة تصريف للتروية. ثم قم بتقطيع الحجاب الحاجز بالمقص ، مع الحرص على تجنب الرئتين والقلب. لفضح الجانب الأيسر من القلب ، استخدم حقنة سعة 10 مليلتر مزودة بإبرة قياس 27 لتنفيض القلب يدويا باستخدام PBS.

يجب تصريف الدم المتبقي من شق الوريد البابي. ثم استخدم مقصا حادا وغير حاد لقطع القفص الصدري بعناية على طول القص. الحرص على تجنب قطع القلب والرئتين.

اعزل القلب والرئتين برفق ، ثم قم بقص كل قسم من القفص الصدري بعناية باستخدام المقص الحاد الحاد بالقرب من العمود الفقري قدر الإمكان. بعد إزالة كلا قسمي الأضلاع بالكامل ، افصل الغدد اللعابية لكشف القصبة الهوائية وقطع العضلات التي تغطي القصبة الهوائية بعناية دون قطع القصبة الهوائية نفسها. الآن افصل الترقوة وأمسك الغدة الصعترية برفق ، وارفعها بعيدا عن القلب.

ثم قم بإزالة الغدة الصعترية بالمقص للعناية بتجنب قطع القلب أو الرئتين. بعد ذلك ، استخدم مقصا حادا بزاوية لعمل شق أفقي صغير كبير بما يكفي لتأمين قنية بإحكام في القصبة الهوائية ، حلقة إلى حلقتين أسفل الحنجرة. ثم أدخل قنية بحيث تمتد النهاية المدببة من حلقتين إلى ثلاث حلقات قصبة هوائية.

أسفل الشق ، مرر خياطة حريرية بين القصبة الهوائية والمريء ، واسحب الخيط بإحكام على القنية لتثبيتها. ثم املأ حقنة سعة مليلتر واحد ب HBSS وأدخل إغراءها برفق في القنية باستخدام حركة بطيئة ولكن ثابتة. بعد ذلك ، قم بحقن ما يقرب من 900 ميكرولتر من HBSS في القصبة الهوائية لتضخيم الرئتين ، ثم على الفور مع سحب HBSS ، قم بتوزيع الصمام المستعاد في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

بعد تكرار الغسيل مرتين أخريين لجمع ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من الصمام. قم بتخزين الصمام على الجليد لتشريح الرئتين لتحليل الأنسجة المرضية ، أدخل حقنة سعة 10 ملليلتر في حامل نفخ الرئة وقم بتوصيل الأنبوب بالإغراء ، والإغراء بقضيب التوقف وقضيب التوقف بالمحقنة ، وتأكد من أن محبس المحبس في الوضع المغلق ، ثم املأ المحقنة بمحلول فورمالين محايد. عندما تمتلئ المحقنة بالكامل بالمثبت ، ضع منشفة ماصة أسفل الطرف المفتوح للأنبوب وافتح قضيب التوقف للسماح للمثبت بملء الأنبوب.

بمجرد أن يبدأ المثبت في التدفق من الأنبوب ، أغلق قضيب الإيقاف على الفور وأعد ملء المحقنة إلى الأعلى باستخدام التثبيت. ثم يمر برفق قطعة ثانية من خيط الخياطة تحت القصبة الهوائية ، ما يقرب من حلقة إلى حلقتين من القصبة الهوائية. أسفل نهاية القنية ، اربط عقدة واحدة فضفاضة في الخيط ثم أدخل الأنبوب من نفخ الفأر.

قف في القنية. افتح قضيب التوقف واترك الرئتين تمتلئ بتضخم الجاذبية. وبعد ذلك بمجرد أن تصل الرئتان إلى الحد الأقصى لمستوى التضخم ، اسحب الخيط بإحكام واربط عقدة ثانية.

أغلق قضيب التوقف وقم بإزالة الأنبوب من القنية ، ثم أمسك الخيط بالملقط. اسحب الخيط بقوة لأسفل باتجاه التجويف الصدري واسحب القنية برفق نحو أنف الفأر لإزالة القنية. بعد ذلك ، ارفع القصبة الهوائية برفق بعيدا عن تجويف الرقبة واستخدم مقصا غير حاد لقطع تدليل القصبة الهوائية إلى خياطة المد والجزر.

بمجرد أن تصبح القصبة الهوائية خالية من الأنسجة الأساسية ، ابدأ في سحب القصبة الهوائية بعيدا عن الفأر ورفع الرئتين برفق من التجويف الصدري. ثم قم بقطع النسيج الضام الذي يحمل الرئتين في التجويف الصدري بقوة تصاعدية ثابتة واستمر في سحب القصبة الهوائية بعيدا عن جسم الفأر ، مع الحرص على عدم قطع الرئتين. أخيرا ، قم بإصلاح الرئتين في 10 ملليلتر من الفورمين المخزن مؤقتا.

في نماذج التعرض ل LPS ، سواء درجة حرارة الجسم أو الوزن ، وعلاماتنا البديلة النموذجية لمراضة وتطور المرض ، سيؤدي تحدي LPS إلى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم خلال الساعات الست الأولى كما هو موضح في الرسم البياني ، والذي يزداد تدريجيا مرة أخرى إلى خط الأساس على مدار 24 ساعة. ومع ذلك ، يتناقص وزن الجسم بشكل مطرد على مدار 24 ساعة عندما يصل إلى ذروته ويتعافى تدريجيا خلال ال 48 إلى 72 ساعة القادمة. وبالتالي ، فإن درجة حرارة الجسم هي علامة أكثر ملاءمة لتقييم المراحل المبكرة من بدء الالتهاب.

في حين أن وزن الجسم يكون أكثر موثوقية خلال المراحل اللاحقة من التسبب في المرض والتعافي ، فإن التعرض لمجرى الهواء LPS يؤدي إلى تدفق كبير للكريات البيض. يمكن ملاحظة الخلايا في الرئتين خلال الساعات الست الأولى المرتبطة بالاستجابة المناعية الفطرية للمضيف في صمام الصمام. ثم تستمر الخلية في الزيادة خلال ال 24 إلى 48 ساعة القادمة عندما تصل الاستجابة المناعية إلى ذروتها وبالتالي تدخل فترة حل الالتهاب بحلول 24 ساعة ، يوجد عدد كبير من العدلات في الرئتين ويمكن ملاحظتها في الصمام بعد التلوين التفاضلي.

توفر تقييمات خلوية الصمامات تقنية قوية وقابلة للقياس الكمي لتوصيف الخلايا المرتبطة بالاستجابة المناعية للمضيف في الرئتين. تتوافق هذه الزيادة مع التدفق الكبير للعدلات إلى الشعب الهوائية والأوعية الدموية وحمة الرئة. يمكن تقييم أمراض الرئة بشكل فعال باستخدام نظام تسجيل شبه كمي كما يمكن ملاحظته في الصورة.

LPS إلى زيادة كبيرة في التهاب محيط الأوعية الدموية والتهاب محيط القصبات الهوائية والمتني. تحفز إدارة LPS مستويات عالية من الوسطاء الموضعيين والجهازيين المؤيدين للالتهابات ، بما في ذلك العديد من السيتوكينات المرتبطة بالاستجابة المناعية الفطرية كما اكتشفتها Eliza تشمل السيتوكينات الشائعة التي يتم تنظيمها في الرئتين بعد إعطاء LPS TNF و alpha IL one beta و IL six. يمكن أيضا تقييم مستويات السيتوكين الجهازية في المصل باستخدام نفس التقنيات الموضحة في تقييمات الأمعاء.

تسهل طريقة تثبيت إزاحة الجاذبية ظروف التقييم النسيجي المرضي المثلى مقارنة بالرئتين غير المنتفختين أو رئتي التضخم اليدوي المثبتة بالجاذبية. يظهر التضخم ميزات موحدة ، مما يسمح بتسجيل دقيق ، وتقليل الضرر السنخي ، والتصور المحسن ، وتقييمات الدقة العالية للالتهاب ، وعادة ما يؤدي التضخم اليدوي للرئتين إلى مناطق تضخم غير منتظمة. غالبا ما يتم تضخيم هذه المناطق جزئيا ، مما يؤدي إلى انهيار الأنسجة الذي يخطئ عادة في اعتباره سمات مرضية من قبل المراجعين المبتدئين.

التضخم اليدوي أيضا إلى تضخم مناطق الرئتين بشكل مفرط ، مما يؤدي إلى تلف الفراغات السنخية على نطاق واسع. تظهر الرئتان غير المنتفختين الفراغات السنخية المنهارة والمناطق التي يصعب حلها وتقييمها دون تدريب مكثف. وبالمثل ، نظرا لانهيار العضو ، لا تسمح هذه التقنية بتصور الرئتين كما تظهر في الموقع.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز وتقييم التهاب الرئة الحاد بوساطة LPS في الفئران باستخدام إجراء بسيط غير جراحي للفم والبلعوم والقصبة الهوائية وحصاد الأنسجة.