نص والمستقلب التنميط لتقييم شجرة التبغ والحور كمادة وسيطة لصناعة القائمة على الحيوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء وتحسين بيانات تسلسل المستقلب والحمض النووي الريبي من مادة أوراق شجرة التبغ للتقديرات الموجهة نحو بيولوجيا الأنظمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع المواد البيولوجية لسلسلة الأوراق التنموية أولا. الخطوة الثانية هي إجراء استخراج المواد باستخدام المذيبات المناسبة التي تعتمد على التحليل اللاحق.

بعد ذلك ، يتم قياس المستقلبات والهيدروكربونات باستخدام كروماتوغرافيا الغاز أو قياس الطيف الكتلي أو GCMS ويتم تحليل النصوص باستخدام الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. في النهاية ، يتم استخدام الجمع بين توصيف المستقلب والتنميط النسخي عبر تسلسل الحمض النووي الريبي لإظهار كيفية تطوير أوراق شجرة التبغ للهيدروكربونات طويلة السلسلة والمركبات المهمة الأخرى. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد وتحديد المستقلبات المفيدة المهمة المصنوعة في أوراق شجرة التبغ.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستقلاب شجرة التبغ. يمكن استخدامه أيضا لأنظمة أخرى مثل التبغ أو الأنواع ذات الصلة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن أوراق شجرة التبغ يصعب استخراج الحمض النووي الريبي الجيد منها.

في فيديو Bioo PRO المتعدد هذا ، سترى أعضاء من مجموعة FERNA يستخرجون ويصنعون الملف الشخصي. باستخدام GCMS ، سترى أيضا عضوا من مجموعة فريزر يستخرج الهيدروكربونات وأيضا عضوا واحدا من مجموعتي الخاص الذي سيستخرج الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي ابدأ بزراعة نباتات neko Oceana Glauca في أواني قطرها 30 سم تحتوي على M اثنين من وسط النمو الاحترافي كما هو مفصل في بروتوكول النص لتحضير المستقلبات الأولية ، احصاد أوراق وسيقان النبات وتجميد المواد على الفور تجميد المواد النباتية المجمدة عن طريق التجفيف بالتجميد لمدة ثلاثة أيام ، ثم طحن العينات المجففة بالتجميد بواسطة مطحنة الخلاط مع كرات معدنية ، وقم بتقطيع المواد الجافة المطحونة الناعمة الناتجة في أنبوب طرد مركزي ملليلتر أو قارورة زجاجية. بعد ذلك ، قم بنقل 10 ملليغرام من الأوراق أو 20 ملليغرام من المواد النباتية الجافة المطحونة في مليلترين من الأنابيب السفلية المستديرة.

أضف 1.4 مل من الميثانول 100٪ والدوامة لمدة 10 ثوان. ثم أضف 60 ميكرولترا من الضلع أتول كمعيار كمي داخلي قبل الدوامة. لمدة 10 ثوان إضافية ، أضف كرة واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ وقم بتجانس المادة باستخدام مطحنة الخلاط لمدة دقيقتين عند 25 هرتز بعد الطرد المركزي لمدة 10 دقائق.

عند 11 ، 000 مرة من الجاذبية ، انقل المادة الطافية إلى قارورة زجاجية. أضف 750 ميكرولتر من الكلوروفورم و 1.5 مل من الماء قبل تدوير المزيج لمدة 10 ثوان. ثم انقل 150 ميكرولترا من المرحلة العليا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك ، جفف العينات باستخدام فراغ سريع. من الضروري تقليل العينات إلى الجفاف لمدة تتراوح بين ثلاث و 24 ساعة حتى لا يوجد سائل متبقي. بمجرد أن يجف ، أضف 40 ميكرولتر من هيدروكلوريد الميثين.

ثم رج المزيج في شاكر كتلة حرارية أفقية لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. أضف 70 ميكرولترا من مزيج M-S-T-F-A قبل رجها مرة أخرى لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. قم بتدوير القطرات الموجودة على الغطاء عن طريق الطرد المركزي القصير من قبل ، قبل نقل السائل إلى قوارير زجاجية مناسبة لتحليل GC MS.

بعد تحليل GCMS للبيانات عن طريق تكوين برنامج لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي وتحديد تحليل البيانات المراد معالجتها. قم بإعداد جدول بالقمم المكتشفة ذات الأهمية وفقا للفئة المركبة. تحديد القمم من خلال تحالف المركبات القياسية ، ثم التعليق على القمم المكتشفة باستخدام تحليل قياس الطيف الكتلي ، وخوارزميات التوصيف الهيكلي ، ومسح الأدبيات ، والبحث عن قاعدة بيانات المستقلبات لاستخراج الهيدروكربونات.

اغمر ما يقرب من 200 ملليغرام من أوراق ncoa glauco المعسرة حديثا لمدة دقيقتين إلى 20 دقيقة ، وقم بإزالة الأوراق وجفف المذيبات تماما عن طريق التبخر الدوار. ثم أعد تعليق العينات في مليلتر واحد من الهكسان من الدرجة HPLC. تابع إجراء تحليل GCM للعينات باستخدام المعلمات المفصلة في بروتوكول النص.

قم في البداية بمعالجة مكونات الكروماتوجرام باستخدام MS آلي. نظام التفكيك وتحديد الهوية و NIST 98 MS. مكتبة. تأكد من تحديد هيدروكربونات الأكان المشبعة طويلة السلسلة من خلال مقارنة أوقات الاستبقاء وأنماط التجزئة الكلاسيكية بالمعايير الأصلية المعروفة. بعد ذلك ، حدد الهيدروكربونات كميا من خلال مقارنة مناطق الذروة المتكاملة مع منحنيات استجابة الجرعة.

تم إنشاؤه من معايير أصلية ، وحساب الوسائل والخطأ المعياري للوسائل باستخدام برنامج Excel. يجمع هذا البروتوكول بين استخراج الحمض النووي الريبي TRIOL ومجموعة RN سهلة للحصول على طحن الحمض النووي الريبي عالي الجودة 100 ملليغرام من المواد النباتية المجمدة في أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي ملليلتر مع كرة معدنية بواسطة مطحنة خلاط. بعد تجانس العينة ، أضف ملليلترا واحدا من التريول بعد الطرد المركزي للمادة لمدة 10 دقائق عند 12،000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب تفاعل جديد. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم واقلب الأنبوب عدة مرات قبل احتضانه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي المزيج لمدة 15 دقيقة.

كما كان من قبل ، انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب تفاعل جديد. أضف ما يقرب من 2.5 حجم من الإيثانول. اقلب الأنبوب عدة مرات واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد ذلك ، انقل العينة بما في ذلك أي راسب إلى عمود دوران. قم بالطرد المركزي للعمود لمدة 15 ثانية عند 8 ، 000 مرة من الجاذبية وتخلص من التدفق من خلاله. أضف 700 ميكرولتر من مخزن الغسيل RW one ، والذي يتم توفيره في مجموعة الاستخراج إلى عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي.

مرة أخرى ، بعد التخلص من التدفق ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني ، كما توفرها المجموعة إلى عمود الدوران. قم بالطرد المركزي للعمود مرة أخرى وتخلص من التدفق من خلاله قبل إضافة المزيد من RPE المخزن المؤقت والطرد المركزي. كما كان من قبل ، ضع عمود الدوران في أنبوب تفاعل جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 50 ميكرولترا من أجهزة الطرد المركزي المائية الخالية من الحمض النووي الريبي ، العمود لمدة دقيقة واحدة عند 8،000 مرة من الجاذبية لإزالة الحمض النووي الريبي.

قم بإزالة الحمض النووي المتبقي باستخدام مجموعة خالية من الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. كخطوة أخيرة ، حدد جودة الحمض النووي الريبي. يجب أن يحتوي الحمض النووي الريبي على أرقام سلامة الحمض النووي الريبي أعلى من ثمانية قبل إرسال الحمض النووي الريبي لتسلسل الجيل التالي.

يظهر ملف تعريف HPLC نتيجة تمثيلية لتحليل الأيزوبرينويد لمستخلصات أوراق ncoa glauca. تم الكشف عن المتساوي المختلف من C 40 وما فوق باستخدام كاشف مصفوفة الصمام الثنائي الضوئي. تم شرح القمم بناء على كروماتوغرافيا الكود والمقارنة الطيفية بين المعايير الأصلية.

الكروماتوغرام MS هو نتيجة تحليل مستقلب الأولي من ncoa وأوراق الجلوكو والمواد الجذعية. يتم أيضا إعطاء طيف MS للذروة المقابلة للسيرين ، على سبيل المثال ، يتم عرض الإخراج التمثيلي للمحلل الحيوي المستخدم لتحديد جودة الحمض النووي الريبي. تتوافق القمتان الرئيسيتان في الكروماتوجرام مع 18 ثانية و 25 ثانية ريبوسومية ، يشير الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي الريبي السليم في هذه العينة.

ستظهر قمم إضافية من الحمض النووي الريبي الريبوزومي المجزأ في حالة الحمض النووي الريبي المتدهور جزئيا أو بشدة بمجرد إتقانه. يمكن إجراء هذه التقنية بسرعة وهي متوافقة مع تحليل المستقلبات الأخرى باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أو طرق أخرى لتحليل الحمض النووي الريبي للإجابة على أسئلة إضافية مثل إنتاج الحمض النووي الريبي الصغير أو التعبير عن جينات معينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية استخراج وتقييم بيانات المستقلب من شجرة التبغ.