طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية الخلايا العقدية الشبكية بشكل انتقائي في مستحضر الجبل بالكامل عن طريق حقن جذع العصب البصري لصبغة مؤشر الكالسيوم. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن صبغة مؤشر الكالسيوم عالية التقارب أولا ، مثل التدفق الرابع في جذع العصب البصري. بعد ذلك ، يتم عزل شبكية العين عن كوب العين وتقسيمها إلى أرباع لتركيبها على شريحة زجاجية في غرفة تسجيل تم إعدادها لتقليد الظروف الفسيولوجية ، مساهمات قنوات الكالسيوم ذات الجهد المسور في إشارة الكالسيوم.

في الخلايا العقدية الشبكية يمكن قياسها في الخلايا العقدية التي تم إزالتها باستخدام حاصرات القنوات. في النهاية ، يمكن أن توفر النتائج قياسات شبه كمية لمساهمة قنوات الكالسيوم المتعلمة بالجهد في إشارة مثل إشارة الكالسيوم التي تثيرها نسبة عالية من البوتاسيوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التثقيب الكهربائي والتحميل السائب ، هي القدرة على تسمية الخلايا العقدية الشبكية ومحاورها بشكل انتقائي في مخزن تحضير كامل ، وتشريح عيون راد وسبات وسط أهداف أو حل مشابه.

الآن ، إذا كنت تنوي إجراء تجارب تصوير الكالسيوم ، فقم بإعادة ملء الخلايا العقدية الشبكية بالتدفق الأربعة. حقن 0.5 ميكرولتر من 40 ملليمولار تدفق أربعة ملح خماسي البوتاسيوم ، المعاد تكوينه في الماء في العصب البصري ، وجذع الجذع خلف مقلة العين بمقدار ملليمتر تقريبا. انقل مقلة العين إلى جرس الثدييات.

فقاعات مع 95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، أو ساعة في درجة حرارة الغرفة. حافظ على التحضير في الظلام. قم بتشريح العينين تحت المجهر بكثافة الضوء الخاضعة للرقابة.

باستخدام شفرة حلاقة ، قم بعمل شق صغير برفق في مقدمة مقلة العين وإزالة القرنية. ثم قم بإزالة العدسة من سطح الشبكية الداخلي باستخدام الملقط. امسك الصلبة بإحكام.

عند إزالة الجسم الزجاجي بالملقط الآخر ، قشر القاعدة الزجاجية برفق باتجاه مركز شبكية العين. يمكن معالجة المستحضر الناتج المسمى الكوب I لإعداد الحامل الكامل للكيمياء المناعية ، أو إعداد تصوير الكالسيوم ، أو تحضيره لأقسام الشبكية المستعرضة لعمل مستحضر كامل للتركيب الكيميائي المناعي. أولا ، قم بعمل أربع جروح في شبكية العين حتى تصبح مسطحة.

ضع شبكية العين على شريحة الغطاء الزجاجي بحيث تكون طبقة الخلية العقدية متجهة لأسفل. ثانيا ، أضف قطرة من المحلول إلى شبكية العين وقم بتغطيتها بورق ترشيح السليلوز إذا لزم الأمر ، وقم بتسطيح شبكية العين بفرشاة أو ملقط. ثالثا ، عندما تكون شبكية العين مسطحة تماما وتنفصل عن ورق الترشيح ، ضعها مرة أخرى في المحلول.

لمعالجة المستحضر أولا ، انقله إلى 4٪ ألدهيد بارافورم لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم اغسل شبكية العين ثلاث مرات في محلول فوسفات 0.1 مولار عند درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة لكل غسلة لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك ، احتضان شبكية العين في 500 ميكرولتر من محلول الانسداد طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

هذا المحلول عبارة عن مصل ماعز طبيعي بنسبة 5٪ أو مصل حمار في مخزن فوسفات مع 0.3٪ تريتون و 0.1٪ أزيد الصوديوم على مدار الأيام الخمسة إلى السبعة القادمة ، يحتضن شبكية العين في محلول الأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية. يجب التوصل إلى تركيبة هذا الحل تجريبيا. اغسل محلول الجسم المضاد الأساسي تماما كما تم غسل المثبت.

ثم احتضان شبكية العين في الجسم المضاد الثانوي بتركيز واحد إلى 1000 بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي بثلاث غسلات أخرى ومخزن الفوسفات. ثم قم بتركيب شبكية العين للتصور وإغلاقها بطلاء الأظافر.

يجب تخزين هذه الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية. ابدأ بعمل تحضير حامل كامل لتصوير الكالسيوم من الكوب الأول في الرنين. أولا ، قم بقطع أنسجة الشبكية إلى أرباع.

ضع رباعا واحدا مسطحا على غرفة التسجيل بحيث تكون طبقة العقدة متجهة لأعلى ، وبالتالي تكون طبقة المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل. جفف المنطقة المحيطة بعناية بمنديل كيم وضع القيثارة المدهونة برفق على المنديل. الآن قم بتحميل مستحضر الشبكية على الحفارة وقم بإنهاء إعداد نظام الصهر الفائق المدفوع بالجاذبية الثماني القنوات.

إذا تحركت شبكية العين المثبتة بعد وضع القيثارة ، فقم بإزالة القيثارة وتنظيفها بعناية. جفف المنطقة المحيطة بشبكية العين وأعد تركيب القيثارة الفائقة. قم بدمج غرفة التسجيل بمحلول جرس الثدييات وحافظ على فقاعات المحلول بشكل مستمر بنسبة 95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

أولا ، كعنصر تحكم بدون أدوية ، قم بإجراء نبضتين مرتفعتين من البوتاسيوم من ثلاثة ملليمولار إلى 60 ملليمولار لمدة 33 ثانية. عند إزالة الاستقطاب ، يجب على RGC تنشيط قنوات الكالسيوم ذات الجهد المسور إذا كان المستحضر يعمل. الآن تابع التجارب.

يشيع استخدام مانع قنوات الكالسيوم المسورة بالجهد من النوع Nifedipine و L لتقييم مساهمة قنوات الكالسيوم ذات الجهد المسور من النوع L في كوبالت إشارة الكالسيوم التي أثارت إزالة الاستقطاب. يمكن استخدام مانع قناة الكالسيوم غير المحدد لحظر قنوات الكالسيوم ذات الجهد غير الانتقائي. امسح الإعداد كل خمس ثوان لتصور والحصول على صور ل rgc الفلوري.

استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة. يجب ضبط الإثارة على 488 نانومتر ويجب جمع الانبعاث باستخدام مرشح LP 505 نانومتر. باستخدام البروتوكولات الموصوفة ، تم إجراء وضع العلامات المناعية ضد بروتين الخلية العقدية R-B-P-M-S ، وهو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبي مع تدفق التضفير المتعدد. أربعة.

اقتصر التلوين بالفعل على الخلايا العقدية بناء على مواصفات الجسم المضاد. بعد ذلك ، تمت دراسة مساهمة قنوات الكالسيوم ذات الجهد المسور في إشارة الكالسيوم في R GCs باستخدام قيم شدة الفلورسنت المكتسبة من rgc. على مستويات خط الأساس ، يمكن رؤية محاور RGC و RGC المسمى بالتدفق الرابع.

من أجل الحصول على قيم شدة الفلورسنت ، تم وضع عائد الاستثمار على الخلية العقدية ، سوماتا و / أو المحاور. بعد تطبيق نسبة عالية من البوتاسيوم على مستحضر الحامل بالكامل ، زادت إشارة الفلورسنت الخاصة ب RG C'S. تبع ذلك انخفاض لاحق في قيم شدة التألق في وجود الكوبالت خلال نبضة البوتاسيوم العالية الثانية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحميل خلايا العقدة الشبكية بشكل انتقائي بمؤشر الكالسيوم الاصطناعي يموت في إعداد التثبيت بالكامل.