طبقة رقيقة الكروماتوجرافي (TLC) فصل واختبارات بيولوجية من المستخلصات النباتية لتحديد المركبات المضادة للميكروبات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد نواتج الأيض النباتية التي تمتلك خصائص مضادة للبكتيريا اللاهوائية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق فصل مستخلص نباتي باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو TLC. بعد ذلك، يتم تقطيع المخطط الكروماتوغرافي إلى مناطق تشتمل على مركب واحد أو أكثر.

توضع المناطق بعد ذلك على آغار ملقح ببكتيريا لاهوائية ثم تُحضن. وعقب فترة التحضين، تُزال المناطق وتُصبغ الأطباق لتحديد المركبات التي تثبط النمو البكتيري. وتكشف البيانات الناتجة عن وجود أو غياب المستقلبات النباتية المضادة للميكروبات.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال تغذية المجترات، مثل آثار المستقلبات الثانوية النباتية على استهلاك العناصر الغذائية من قبل كائنات مجهرية محددة. ورغم أن هذه الطريقة تكشف عن المركبات النباتية المثبطة لبكتيريا الكرش، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً للكشف عن المركبات المثبطة لأنواع أخرى من البكتيريا أو الفطريات.

في هذا البروتوكول، ستُستخدم المركبات الفينولية المستخلصة من البرسيم الأحمر لتوضيح كيفية تحديد المركبات المضادة للميكروبات عن طريق المقايسة الحيوية بالتلامس. ابدأ بتنظيف ألواح كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) مع العمل داخل خزانة استرداد الغازات. قم بتحضير كمية كافية من مذيب التنظيف لتغطية قاع غرفة تحضير الـ TLC، بالإضافة إلى الحافة السفلية للوح الـ TLC.

يتم تحضير محلول إيثيل أسيتات وميثانول بنسبة 2:1 ووضعه داخل الغرفة هنا. بعد ذلك، مع ارتداء القفازات والعمل داخل خزانة استخلاص الغازات، تُستخدم المقصات لقص ألواح السيليكا المرنة ذات الخلفية الألمنيوم أو البلاستيك لتناسب حجم غرفة التظهير.

أدخل الألواح في الغرفة بحيث تستند القمم إلى جدران الغرفة. يجب ألا تتلامس الألواح مع بعضها البعض. غطِّ الغرفة واترك المذيب يرتفع عبر الألواح بواسطة الخاصية الشعرية.

عندما يصل المذيب إلى أعلى الصفائح، أخرجها من الحجرة ورتبها في وضع عمودي داخل خزانة سحب الغازات حتى يتبخر المذيب. وبمجرد جفاف الصفائح، تحقق مما إذا كانت الشوائب قد هاجرت بالقرب من الجزء العلوي من صفائح TLC. ستظهر هذه الشوائب على شكل حزمة صفراء تحت الضوء المرئي أو حزمة فلورية تحت الأشعة فوق البنفسجية.

إذا ظل معظم اللوح يميل إلى اللون الأصفر، كرر عملية التنظيف في غرفة TLC نفسها باستخدام المذيب ذاته. بعد إخراج ألواح TLC من الغرفة، تخلص من المذيب. اترك المذيب المتبقي يتبخر تماماً قبل استخدام الغرفة في الجزء التالي من البروتوكول.

بعد ذلك، ولإزالة الرطوبة المتبقية التي قد تؤثر على هجرة المركبات على السيليكا، ضع الصفائح بشكل رأسي في فرن تجفيف عند 100 degrees Celsius لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة للصفائح التي يبلغ مقاسها 20 by 20 centimeter، ولمدة خمس دقائق للصفائح التي يبلغ مقاسها 7 by 10 centimeter. وبمجرد جفاف الصفائح، اتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل تحميلها بالمستخلصات. ولتجهيز حجرات فصل المستخلصات، استخدم المقص لقص قطعة من ورق الترشيح بحيث يكون طولها أقل قليلاً من ارتفاع الحجرة وعرضها حوالي نصف محيط الحجرة.

ستعمل هذه الورقة كفتيلة لسحب المذيبات إلى أعلى جدار الغرفة وإشباع الغرفة بالأوراق المذيبة، مما يؤدي إلى تحسين إمكانية تكرار عمليات الفصل. اخلط المذيبات هنا داخل خزانة استخلاص الغازات. المذيبات المستخدمة هي ethyl acetate والميثانول بنسبة حجمية 4:1. صب خليط المذيبات في الغرفة ثم قم بتغطيتها.

استخدم قلم رصاص لوضع علامة خفيفة تحدد نقطة الأصل على لوحة TLC بحيث تكون أعلى من مستوى سطح مذيب التطوير في الحجرة. إذا كانت المادة الماصة في لوحة TLC لينة وسهلة التلف، ضع علامات عند الحواف كما هو موضح هنا. بعد ذلك، أذب المستخلصات في كمية كافية من المذيب العضوي للحصول على محلول مركز بدلاً من معلق عكر.

المذيب المستخدم هنا هو الميثانول. يتم تحميل المعايير والعينات على شكل نطاقات ضيقة باستخدام الماصات الشعرية الدقيقة أو حقنة ميكرولترية، مع ترك هامش بمقدار سنتيمتر واحد على جوانب اللوحة؛ ويساعد تهوية اللوحة أو وضعها في خزانة استخلاص الأبخرة على تجفيف النطاقات بسرعة أكبر. وبمجرد جفاف النطاقات، يتم تحميل العينات مرة أخرى في نفس النقطة أو فوق البقعة السابقة.

إذا كانت هناك حاجة إلى تركيز أعلى من العينة على اللوحة، كرر العملية حسب الحاجة في حجرة TLC. تأكد من تشبع الفتيلة بالكامل بالمذيب. ثم ضع اللوحات داخل حجرة TLC باستخدام ملقط أو كماشة.

يجب ألا تلامس الصفائح الفتيلة. غطِّ الحجرة واترك الصفائح تتطور قبل أن يصل جبهة المذيب إلى أعلى الصفيحة. أخرج الصفائح من خزان TLC وحدد ارتفاع جبهة المذيب باستخدام قلم رصاص.

اترك اللوح ليجف. في خزانة استخلاص الغازات، قم بتطوير أي ألواح TLC متبقية في غرفة TLC نفسها، والتي تكون صالحة للاستخدام بشكل عام طوال اليوم إذا بقيت مغلقة. إذا انخفضت كمية المذيب في الغرفة بشكل ملحوظ، قم بتحضير المزيد من خليط المذيب بعد جفاف الألواح.

قم بتصور الحزم تحت الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية UV. وتعتبر غرفة العرض المزودة بمصباح UV محمول وسيلة مريحة، خاصة إذا كان المصباح قادرًا على اكتشاف المركبات عند كل من الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة 254 nanometer والأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة 365 nanometer. استخدم قلم رصاص لتحديد الحزم باستخدام نظام توثيق الصور الهلامية المجهز بإضاءة علوية، وإضاءة UV و/أو إضاءة مرئية للحصول على صور للألواح.

أخيرًا، للمساعدة في توصيف الحزم، احسب عامل الاستبقاء أو قيم RF عن طريق قياس المسافة التي قطعها المركب أولاً، ثم قياس المسافة التي قطعها المذيب وقسمة القيمة الأولى على الأخيرة. وبمجرد تحديد مواقع الحزم، يمكن تخزين الصفائح لاستخدامها لاحقًا في المقايسة الحيوية.

غلف الأطباق بالبلاستيك وغطها بورق الألومنيوم. خزن الأطباق في درجة حرارة -20 °C. تعتمد أقصى مدة للتخزين على استقرار المركب لأن السيليكا ليست متعادلة.

قد تتحلل بعض المركبات أثناء وجودها على لوح TLC. كجزء من التحضير لمقايسة السيرة الذاتية بالتلامس، قم بتحضير وتلقيح البكتيريا المنتجة للأمونيا بكثافة أو وسط HAB تحت ظروف لاهوائية. المزرعة المستخدمة في هذه الحالة هي Clostridium stickland eye strain sr.

قم بتنمية المزرعة حتى تصل إلى الطور الأسي أو الطور الساكن عند 39 درجة Celsius. استخدم تقنيات لاهوائية معقمة عند التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية. قم بتحضير تركيز 0.75% weight per volume.

يُضاف الآجار إلى نفس الوسط المستخدم في تنمية البكتيريا بعد أن تنخفض درجة حرارة الآجار إلى أقل من 60 °C. يتم تلقيح الآجار المنصهر بنسبة 1% حجم/حجم من المزرعة ويُخلط بلطف، ثم يُوضع فوراً في غرفة لاهوائية ويُصب في أطباق بتري بلاستيكية بمقاس 15 × 100 مليمتر. باستخدام المقص، يتم قطع لوحة TLC إلى مناطق تحتوي على النطاق أو النطاقات المراد دراستها.

باستخدام قلم تحديد، قم بتمييز الجهات الخلفية للأطباق. ضع شريط TLC غير مستخدم على طبق آغار كعينة ضابطة. ثم ضع النطاقات بحيث يكون الوجه لأسفل على أطباق الآغار.

قم بتحضين الأطباق بحيث يكون جانب الآجار للأسفل في حاضنة الغرفة اللاهوائية لمدة 24 ساعة عند 39 degrees Celsius. استخدم الملقط لإزالة نطاقات TLC من أطباق الآجار أثناء وجودها داخل الغرفة اللاهوائية.

أضف صبغة التترا أوليم الحمراء (tetra oleum red) قطرة تلو الأخرى على أسطح أطباق الآجار. اترك اللون يتطور لمدة 20 دقيقة على الأقل. عندما يتلون طبق التحكم باللون الأحمر تماماً، أخرج الأطباق من الغرفة اللاهوائية.

تعد بكتيريا Clostridium stick Landi بكتيريا لاهوائية، لذا ستبدأ في فقدان حيويتها فور إخراجها من الحجرة اللاهوائية، إلا أن اللون يظل مستقراً لأكثر من 24 ساعة. باستخدام كاميرا رقمية، قم بتصوير الأطباق تحت الضوء المرئي على خلفية توفر تبايناً كافياً. سيُلاحظ لون أحمر ساطع عندما يتم صبغ الخلايا الحية.

لا تُصبغ الخلايا الميتة. تظهر هنا عمليات فصل ممثلة باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على السيليكا لمستخلصات البرسيم الأحمر التي تحتوي على مركبات فينولية. أدى الفصل باستخدام خلات الإيثيل والهكسان بنسبة تسعة إلى واحد على مسافة 8.5 سنتيمتر إلى ظهور خمس نطاقات، انفصلت إحداها تماماً عن نقطة الأصل.

كانت المعايير التي تم تحميلها هي Formin Bio Canon A وGenine. تم تطبيق أربعة نطاقات من هذا اللوح على مستنبتات تحتوي على Clostridium stick Landi، وهي بكتيريا منتجة للأمونيا بشكل مفرط في الكرش، لمدة 24 ساعة، ثم صُبغت بـ tetra oleum red كما هو موضح هنا. أدى التحضين باستخدام النطاق الأول Bio Canon A وجزء من النطاق الثاني four Monon nein على أغار مستزرع بالبكتيريا إلى ظهور منطقة تثبيط محددة بوضوح.

ومع ذلك، فإن تحضين ما تبقى من النطاق الثاني، إلى جانب النطاقين الثالث والرابع، لم يثبط النمو البكتيري. وقد أظهرت هذه النتائج أن bio Canon A كان مثبطاً لنمو see stickland eye، بينما لم يكن form aone Nein كذلك. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هذه التقنية مرنة.

يمكن استخدام كائنات دقيقة اختبارية أخرى طالما تم اختيار الأوساط المناسبة، وتضمين ضوابط لضمان توافق كيمياء الفصل وطريقة الكشف عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن استخدام تقنيات أخرى مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ومطياف الكتلة للمساعدة في توصيف المركبات المضادة للميكروبات التي تم تحديدها في المقايسة الحيوية.