تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

الهدف العام من هذا الإجراء هو وسم وتقدير كمية الـ RNA الناشئ الذي يتم إنتاجه تحت ظروف المعالجة باستخدام تحليل التصوير الكمي لتحقيق ذلك. يتم معالجة الخلايا المستنبتة والمزروعة على غطاء زجاجي بالقاعدة المعدلة alkein. Five etal uridine، والتي يشار إليها فيما يلي باسم five EU، ثم تُحضن تحت ظروف نقص الأكسجين.

أثناء فترة التحضين، يتم دمج 5-EU خلال عملية تخليق الـ RNA دون مقاطعة آلية النسخ الخلوية. بعد ذلك، يتم وسم 5-EU المدمج فلورياً عن طريق إجراء تفاعل حلقي للأزيد والألكاين بمحفز نحاسي، والمعروف بتفاعل "كليك". ثم يتم تصوير الـ RNA الناشئ الموّسم فلورياً باستخدام المجهر الفلوري، وتُحلل الصور الناتجة لمقارنة كمية الـ RNA المتولدة تحت ظروف المعالجة وظروف التحكم.

يظهر التحليل الإحصائي للبيانات الناتجة التغيرات في توليد الـ RNA الناشئ استجابةً لنقص الأكسجة من خلال قياس دمج خمسة EU والكشف عنها بواسطة المجهر الفلوري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الـ BCR الكمي، في أنها تتيح التصوير المباشر لإنتاج الـ RNA في الخلايا على مستوى الخلية الواحدة. ورغم أننا نستخدم هذه الطريقة هنا لدراسة كيفية استجابة الخلايا لانخفاض الأكسجين، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لدراسة الاستجابات للأدوية العلاجية الكيميائية.

سيقوم جون ليستون، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، بمساعدة إيش كوفا، وهو أيضاً طالب دراسات عليا، وهومانا دروكر، وهي زميلة ما بعد الدكتوراه، بتوضيح الإجراء الخاص باستجاباتنا لاستجابات الإجهاد الإضافية. وأخيراً، سيقوم غاس فيرغسون بتوضيح استخدام برنامج تصور الصور. ابدأ هذه التجربة بغمس عدة شرائح غطاء في 70%ethanol لتعقيمها.

ضع شرائح التغطية على حافة طبق داخل غطاء زراعة الأنسجة واتركها تجف في الهواء تحت التدفق الصفائحي. وبمجرد جفاف شرائح التغطية، ضع شريحة واحدة في كل طبق من ستة أطباق بحجم 3.5 centimeter. أضف 2 mL من وسط DMEM الكامل الدافئ إلى كل طبق.

اضغط لأسفل باستخدام الملاقط للتأكد من بقاء كل شريحة غطاء ملتصقة بقاع البئر. ولفصل خلايا U2 OS عن طبق زراعة الأنسجة، اغسل مرة واحدة باستخدام 3 mL من PBS. ثم ضع 4 mL من trypsin بتركيز 0.05% وEDTA بتركيز 1% الدافئين، وحضن العينة عند 37 °C لمدة سبع دقائق.

بعد مرور سبع دقائق من إضافة Resus، قم بتعليق الخلايا في 6 mL من وسط DMEM الكامل الدافئ لإبطال مفعول trypsin EDTA. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم ازرع في كل طبق من الأطباق ذات القطر 3.5 cm التي تحتوي على شرائح تغطية 2 × 10⁵ من الخلايا. قم بهز الطبق برفق لضمان توزيع الخلايا بشكل متساوٍ، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند 37 °C، و21% oxygen، و5% carbon dioxide للسماح للخلايا بالالتصاق.

في اليوم التالي، أخرج خمسة من الأطباق من الحاضنة. اترك الطبق المتبقي دون تحريك، حيث سيُستخدم كعنصر تحكم إيجابي في ظروف الأكسجين الطبيعية (normoxic positive control).

ضع أربعة من الأطباق في محطة عمل نقص الأكسجين. عرّض الخلايا لظروف نقص الأكسجين لمدة 75 دقيقة، و90 دقيقة، وساعتين، و24 ساعة. وبالنسبة للطبق الآخر.

أضف acton mycin D إلى الوسط بتركيز نهائي قدره 10 µg/mL وأعده إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C تحت ظروف الأكسجين الطبيعية لمدة أربع ساعات. يعمل هذا الطبق كعنصر تحكم سلبي في ظروف الأكسجين الطبيعية (normoxic negative control). وأثناء احتضان الخلايا، قم بتحضير وتجميع الكواشف التالية استعداداً لاختبار click it.

تتضمن مجموعة اختبار click it محلول PBS بدرجة pH تتراوح بين 7.2 و 7.6، و3.7% Paraform aldehyde في PBS، و1% Triton X 100 في PBS، وماء منزوع الأيونات، وثنائي ميثيل سلفوكسيد، و10 molar هيدروكسيد الصوديوم، و37% حمض الهيدروكلوريك، وشرائط مؤشر pH. يجب أن تخطط لتكون مستعداً لبدء اختبار الوسم تحت ظروف المعالجة. وقبل ساعة واحدة من انتهاء المعالجة بنقص الأكسجة (hypoxia)، قم بتحضير محلول عمل بتركيز 2x من EU من المخزون بتركيز 100 millimolar في وسط غذائي كامل مُدفأ مسبقاً لوسم الخلايا.

بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من 2X EU إلى الوسط في الطبق الذي يحتوي على الخلايا المعالجة بـ acton mycin D، وذلك لتخفيف EU إلى التركيز العامل. ثم في غرفة نقص الأكسجة، أضف مخزون EU إلى الخلايا المعالجة بنقص الأكسجة. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة تحت ظروف زراعة الخلايا المعالجة بعد علاج نقص الأكسجة، أو بعد أربع ساعات بالنسبة للمجموعات الضابطة.

اغسل كل طبق مرة واحدة باستخدام PBS وأضف 1 mL من محلول Paraform aldehyde المركز بتركيز 3.7% في ظل ظروف المعالجة، ثم حضنها لمدة 15 دقيقة تحت ظروف المعالجة. بعد التثبيت، أخرج الخلايا من غرفة نقص الأكسجة (hypoxia chamber) وضعها في خزانة سحب الغازات (fume hood). اسكب المثبت مع الحرص على التخلص من نفايات para formaldehyde بطريقة مسؤولة.

بعد ذلك، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. قم بإجراء الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة، مع الحفاظ على جميع المحاليل على الثلج في درجة حرارة تتراوح بين 2 إلى 6 درجة Celsius. بعد ذلك، لنفاذية الخلايا، قم بإزالة محلول الغسيل وأضف 1 mL من 1%tritton X 100 في PBS إلى كل بئر، ثم قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة محلول النفاذية واغسل كل بئر مرة واحدة باستخدام PBS. قم بإزالة محلول الغسيل من الخلايا وأضف 500 microliters من كوكتيل تفاعل مجموعة تصوير RNA المحضر حديثًا إلى كل عينة. احمِ الخلايا من الضوء واتركها لتحضن لمدة 30 minutes في درجة حرارة الغرفة.

بعد فترة التحضين، قم بإزالة كوكتيل تفاعل مجموعة تصوير RNA ومحلول الغسيل. بعد شطف العينات باستخدام 1 mL من محلول التخزين الخاص بمجموعة تفاعل تصوير RNA، يمكن إجراء أي وسم إضافي للأجسام المضادة في هذه المرحلة. ولصبغ DNA، اغسل العينات باستخدام PBS، ثم خفف herst 3, 3, 3, 4, 2 بنسبة 1:1000.

أضف ملليلتر واحد من محلول HERC المخفف في PBS إلى كل منها. احمِ العينات جيداً من الضوء واحضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، قم بإزالة محلول HERC واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لتثبيت شرائح التغطية.

ضع 10 µL من وسط التثبيت في مركز شريحة مجهرية قياسية. ضع غطاء الشريحة بحيث يكون جانب الخلية متجهاً للأسفل فوق قطرة وسط التثبيت. تجنب تكوين فقاعات لأن ذلك سيؤدي إلى حجب عملية الحصول على الصور اللاحقة.

ضع طلاء أظافر شفافاً على محيط غطاء الشريحة لتثبيته على شريحة المجهر. اترك الطلاء ليجف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين العينات المحمية من الضوء عند درجة حرارة -20 °C.

بعد التثبيت، يتم الحصول على الصور باستخدام مجهر ذو مجال واسع قادر على الكشف عن الفلورة. يتم إجراء التصوير باستخدام عدسة غمر زيتية 40 V 1.30 NA، والتقاط الصور بواسطة كاميرا CCD مبردة. يجب تصوير 30 خلية كحد أدنى بعد عملية الحصول على الصور.

استخدم برنامجاً لمعالجة الصور لإزالة الالتفاف (devolve) من الصور. سيؤدي ذلك إلى تصحيح التشوه البصري عن طريق تطبيق صيغة رياضية برمجية على الصور الملتقطة. والنتيجة هي صورة أكثر وضوحاً تضمن قصر التحليل اللاحق على الخلايا المصورة فقط.

بعد ذلك، قم باستيراد الصور إلى برنامج Omer O client. ستظهر صور مصغرة لجميع الصور التي تم الحصول عليها من أجل توحيد إعدادات العرض لجميع الصور في التجربة ذاتها. قم بتطبيق إعدادات العرض من خلايا التحكم تحت الظروف الطبيعية للأكسجين (normoxic cells) على جميع الظروف الأخرى باستخدام أداة تحديد المنطقة ذات الاهتمام ROI في برنامج التحليل.

قم بتحديد النوى من كل صورة باستخدام البرنامج. اختر خيار تحليل الكثافة واستخرج متوسطات الكثافة لكل منطقة اهتمام (ROI) لعدد يتراوح بين 30 إلى 50 خلية. احفظ البيانات ثم احسب المتوسط والانحراف المعياري لكل حالة.

أخيرًا، وباستخدام برنامج لرسم البيانات البيانية، يتم إنشاء مخططات تشتت لجميع قيم متوسط الكثافة الفردية لتعكس التباين بين الخلايا في ظل كل حالة. ويعد رسم بيانات الكثافة بهذه الطريقة مفيداً لأنه يسمح بمقارنة سريعة لنتائج المعالجة، ويوضح بجلاء عدم التجانس الملحوظ ضمن مجموعة الخلايا المعالجة، والذي يكون محجوباً بخلاف ذلك عند استخدام طرق تمثيل البيانات القياسية. وبدلاً من ذلك، يمكن إنشاء رسوم بيانية شريطية لتمثيل متوسط الكثافة بالإضافة إلى الانحراف المعياري لـ RNA الناشئ من أجل التحديد الكمي لإجمالي تخليق RNA في خلايا U2 OS التي عولجت بنقص الأكسجة وزرعت في وجود 5-al uridine أو EU ثم تمت معالجتها وتحليلها.

كما تم توضيحه في هذا الفيديو، تم حساب متوسط شدة الفلورة لجميع الخلايا ضمن كل مجموعة معالجة وتم تمثيلها بيانياً. وفي هذا المخطط الشريطي، استُخدم اختبار T للطلاب (student's T-test) لحساب الاحتمالية الإحصائية لاختلاف كل مجموعة معالجة بشكل ملحوظ عن المجموعة الضابطة. ومن المثير للاهتمام أن هذه البيانات تظهر وجود زيادة ذات دلالة إحصائية في التخليق العام لـ RNA بمرور الوقت.

عندما تُعالج خلايا U2 OS بنقص الأكسجين لمدة تزيد عن ساعة ونصف كما هو متوقع، فإن المعالجة بـ ACTO mycin D تقضي تماماً على شدة الفلورة. تشير هذه البيانات إلى أنه بعد فترات أطول من المعالجة بنقص الأكسجين، تركز الخلية جهودها على إنتاج RNA، حتى في هذه البيئة المعادية التي تفتقر للأكسجين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وسم وقياس RNA الناشئ على مستوى الخلية الواحدة في حالتي نقص الأكسجين والتركيز الطبيعي للأكسجين؛ وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الصبغ المشترك باستخدام أجسام مضادة لـ RNA polymerase وHIF لتحديد ما إذا كانت مستويات RNA polymerase قد تغيرت وما إذا كان HIF قد تم تنشيطه. ولا تنسَ أن التعامل مع الفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيرًا للغاية أثناء تنفيذ هذا الإجراء؛ لذا تأكد دائمًا من ارتداء القفازات والعمل داخل خزانة استخلاص الغازات.