واحد الطول الموجي الظل التصوير من

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس وتقييم سرعة المسار الرأسي والقوى التي يبذلها ديدان خيطية تسبح بحرية باستخدام إشعاع أحادي اللون متشاكه. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إعداد تجربة ظل أحادي اللون متشاكه لديدان *Caenorhabditis elegans* التي تسبح بحرية. بعد ذلك، يتم وضع دودة *C. elegans* بالغة واحدة في غرفة عرض تجربة الظل، والتي تكون عبارة عن وعاء.

يتم تسجيل ظل الدودة أثناء هبوطها عبر شعاع الليزر على شكل مقطع فيديو، ويُستخدم هذا المقطع لتحليل حركة الحيوان. ومن ثم، يتم تحديد مسار الديدان الخيطية التي تسبح بحرية والقوى المرتبطة بها والناتجة عن حركتها. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر التقليدي في مستوى أفقي، في إمكانية استقصاء حركة الكائنات الدقيقة التي تسبح بحرية باستخدام نطاق واسع من الضوء أحادي اللون وبتكلفة منخفضة.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية حول القوى التي تولدها الديدان الخيطية أو تستجيب لها في بيئة سائلة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في استكشاف فكرة الحركة الرأسية للأنواع المجهرية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن الخطوات الإجرائية يصعب تعلمها، حيث يتطلب الأمر بعض التدريب لضبط محاذاة الليزر بشكل صحيح.

علاوة على ذلك، من الضروري قضاء بعض الوقت في المختبر البيولوجي لتعلم كيفية تحضير الديدان، وتجميع الإعداد التجريبي لإنشاء الصور الظلية. استخدم مرآتين أو أكثر لتوجيه ليزر الهيليوم-نيون إلى موسع الشعاع الغاليلِي، حيث يجب أن يزداد قطر الشعاع إلى 12 millimeters. ضع ثقباً صغيراً واحداً أو اثنين في مسار الشعاع لضمان محاذاته بعد خروجه من الموسع.

وجه الحزمة نحو عدسة كوارتز (Q vet) مثبتة. بعد مرور الحزمة، تقوم عدسة (Q vet) بتكبيرها باستخدام عدسة محدبة مستوية ذات طول بؤري موجب قدره 75 millimeters. ثم ضع شاشة على بُعد حوالي 120 centimeters من العدسة، وهي مسافة دقة التحليل المثلى.

قم بوضع كاميرا عالية السرعة في موضع يمكنها من تصوير الشاشة، مثل وضعها بجانب جهاز Q vet. كما يجب وضع مجهر تشريحي بالقرب من جهاز qve لالتقاط الديدان. قم بتثبيت مسطرة شفافة ذات تقسيمات بالملليمتر مؤقتاً في مركز حامل QVAD على الشاشة بالقرب من حافة مجال رؤية الكاميرا.

استخدم خطوط المسطرة لتحديد مسافة المقياس لميليمتر واحد. كرر هذه العملية لكل طول موجي مستخدم، حيث سيختلف الانكسار بسبب الزيغ اللوني في الـ QV والتغيرات في التكبير كما تم وصفه سابقاً. في JoVE، جهز ديدان خيطية بالغة شابة من أجل الـ qve.

قم أيضًا بتحضير نيماتودا ميتة نتيجة التعرض للكلوروفورم. ابدأ بملء جهاز Q Vet بالماء المقطر حتىما قبل الحافة بـ 1 ملم. ابدأ التسجيل مع إضاءة الغرفة، بحيث يكون الخط على الشاشة مرئيًا في البداية، ثم أطفئ أضواء الغرفة.

ثم قم بجمع دودة خيطية (nematode) باستخدام ملقط سلكي من البلاتين. من المهم وضع الديدان في الوعاء عن طريق ملامسة الملقط لسطح الماء قليلاً دون تحريك الوسط. تكون الصورة المسقطة للدودة وعمود الماء مقلوبة.

سوف تبدو الديدان التي تهبط بفعل الجاذبية وكأنها تتحرك للأعلى على الشاشة. قم بتسجيل نحو 20 ثانية لكل دودة، وسجل حوالي 50 دودة لكل حالة. أولاً، استورد الفيديو إلى برنامج تحليل الفيديو.

اضبط المقياس باستخدام علامات الطول الموجودة في الفيديو لتحديد عامل التكبير. ثم ابدأ في تتبع الإزاحة الخطية لرأس الدودة الخيطية المظللة. اختر 10 نقاط بيانات على الأقل على طول المسار المقطوع، بمعدل نقطة واحدة كل 0.3 ثانية تقريبًا.

يتم بعد ذلك حساب السرعة الرأسية من خلال قسمة المشتقة على عامل التكبير. ومن الضروري إنشاء منحنيات منفصلة للإزاحة الأفقية والرأسية، بما أن الجاذبية تؤثر في الاتجاه الرأسي فقط.

إذا شكلت نقاط البيانات خطًا مستقيمًا بشكل عام، فإن المسار يكون خطيًا. ويمكن تجاهل بعض الانحرافات في حركة الرأس. بعد ذلك، من قائمة التحليل، قم بإنشاء خط انحدار خطي عن طريق مطابقة خط مستقيم مع البيانات.

يمثل ميل الخط السرعة الرأسية للدودة. إذا تحركت الدودة بشكل غير خطي، اختر "curve fit" من قائمة التحليل. ومن هناك، قم بملاءمة المنحنى ليكون من الدرجة الثانية أو الثالثة.

يتم استخدام كثير حدود لكل منحنى في المسار لملاءمة المنحنى مع البيانات. ومن خلال تحريك الأقواس الموجودة على كل جانب من الرسم البياني، يتم عرض التعبير الرياضي للمنحنى. ويُعتبر الخطأ النسبي الذي يصل إلى 15% هنا مقبولاً.

أضف منحنيات إضافية حسب الحاجة لتغطية نقاط البيانات وحاول استخدام استكمال الدوال بالشرائح (spline). يجب أن تمتلك ملاءمات المنحنيات نفس الميل عند نقاط التداخل. وتوفر المشتقات الأولى والثانية للمنحنى قيم السرعة والتسارع.

يتم حساب قوة الدفع باستخدام ثلاثة ميكروجرام ككتلة الدودة أثناء الانجراف، ولم يكن هناك فرق ملموس في معدلات هبوط الديدان الحية والميتة. كان معدل الانجراف نحو الأسفل لكليهما 1.5 millimeters per second. ومع ذلك، فإن النيماتودا الحية قادرة على تغيير اتجاهها والسباحة عكس اتجاه الجاذبية، وتُطبق منحنيات الملاءمة على الإزاحة الرأسية للنيماتودا ويتم حساب التسارع من مشتقاتها الثانية.

إن القوى التي تؤثر على الدودة حتى تصل إلى نقطة الالتفاف هي الجاذبية، والسحب، والطفو، والدفع. وتساوي القوة المحصلة مجموعها الاتجاهي. لننظر في مكونات القوة الرأسية.

تتساوى القوة الجاذبية في مقدارها مع قوة الطفو، بافتراض أن كثافة الدودة تقارب كثافة الماء، لذا يمكن تبسيط المعادلة حتى نقطة التحول. تكون قوة السحب بالإضافة إلى قوة الدفع ثابتتين. تكون قوة السحب أكبر في البداية، ولكنها تتناقص تدريجياً حتى تصل إلى الصفر بينما تزداد قوة الدفع عند نقطة التحول؛ حيث لا يوجد سحب رأسي، وتكون قوة الدفع موجهة للأعلى أثناء حركة الدودة.

تزداد قوة سحب الصعود الرأسي في الاتجاه الهبوطي، لذا يجب أن تكون قوة الدفع أكبر من مجموع قوتي السحب والوزن. وقد تم تحليل المسار غير الخطي لهذه الدودة، حيث تبين أنها غيرت اتجاهاتها.

بالنظر إلى إزاحته، نجد أنه تباطأ وبدأ في الدوران عند الثانية 68. ومع ذلك، تناقص التسارع الصاعد باستمرار حتى وصلت قيمة التسارع الصافي إلى صفر عند الثانية 68.5. بعد ذلك، بدأ في التسارع في الاتجاه السالب ليهبط مرة أخرى.

وبناءً على ذلك، عندما كانت السرعة صفراً، كان لدى الدودة دفع علوي ملحوظ تم حسابه بـ 1.32 Pico newton's. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن جمع البيانات في غضون 10 دقائق إذا كانت الديدان جاهزة للالتقاط من البرغي الناقل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على معدل تسجيل الكاميرا ثابتاً لجميع البيانات المجمعة، لأننا نحتاج إلى ضبط معدل الإطارات في برنامج تحليل الفيديو وفقاً لهذا الإجراء. كما يمكن إجراء دراسات أخرى مثل دراسات الطول الموجي الواحد للإجابة على تساؤلات مثل ما هي القوى المبذولة في اتجاهات مختلفة، سواء كانت رأسية أو أفقية.

على سبيل المثال، يمكن لعلماء الأحياء الآخرين المهتمين بخصائص الحركة للكائنات الصغيرة مثل Proti أو غيرها من الكائنات المائية استخدام هذه التقنية البصرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحليل حركة الكائنات المجهرية التي تسبح بحرية باستخدام تكبير صور الظلال، ثم استخدام برنامج لتحليل الفيديو.