إعادة تشكيل β-catenin تدهور في القيطم مستخلصات البيض

ووصف طريقة لتحليل تدهور البروتين باستخدام رديولبلد والبروتينات luciferase المراسل الانصهار في القيطم استخراج البيض والتكيف من أجل الفرز الفائق الإنتاجية للجهري جزيء صغير من تدهور البروتين.

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام نظام مستخلص بيض xenopus الكيميائي الحيوي الخالي من الخلايا لتحليل بيتا كاتين في معدل دورانه. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة و / أو استنفاد المؤثرات المشتبه بها أولا إلى مستخلص بيض xip المنشط من أجل تحديد معدلات دوران بيتا كاتينين كخطوة ثانية خارجية في المختبر ، ونسخ وترجمة بيتا كاتينين ، إما راديو مسمى ب S 35 أو مدمج مع لوسيفيراز يضاف إلى مستخلص البيض XUS ، والذي يتحلل بنشاط في ظل الظروف الأصلية. بعد ذلك ، قم بجمع النقاط الزمنية لتقييم التغيرات في مستويات بيتا كاتين والبروتين بمرور الوقت.

يتم الحصول على النتائج التي توضح ما إذا كان تعديل معين لمستخلص بيض xenopus يزيد أو يقلل من معدلات بيتا كاتين وتدهورها بناء على التصوير الشعاعي التلقائي و / أو الكشف عن اللمعان. تتمثل ميزة هذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل مطاردة النبض أو تجارب مطاردة الدوران في الخلايا المستنبتة في أن مستخلص بيض xenopus يوفر نظاما كيميائيا حيويا خاليا من الخلايا حيث يمكن للمرء تحليل تنظيم البروتين على مستوى البروتين ، ويفتقر إلى التعقيد الإضافي للنسخ النشط. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نقل الإشارة من خلال تحديد منظمات بروتينات الإشارات الرئيسية مثل بيتا كاتينا.

يتيح العمل مع مستخلص xenopus للمستخدم استنفاد مكونات المسار بسهولة وإضافة كمية محددة من البروتين. لتحديد آثاره المعتمدة على الجرعة ، استخدم مستخلص بيض XUS الطازج أو قم بإذابة الثلج بسرعة وتجميدها وضعها على الثلج. قم بإجراء جميع عمليات التلاعب في البرد ، وقم بإعداد الأجسام المضادة المحببة أو حبات التقارب عند واحد من 10 حجم المستخلص من أجل تقليل تخفيف المستخلص ، وسحب أكبر قدر ممكن من السائل من الخرز قبل إضافة المستخلص.

باستخدام نصائح تحميل الجل ذات النهايات المدببة الطويلة هنا ، يضاف المستخلص إلى راتنج ربط ضريبة السلع والخدمات. قم بتدوير مزيج حبة المستخلص على أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بتدوير مزيج حبة المستخلص عند 12 ، 600 Gs في fuge دقيق عند أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية.

الحرص على عدم نقل أي حبات بالمستخلص. انقل المستخلص المستنفد إلى أنبوب دقيق جديد على الثلج. تأكد من كفاءة النضوب عن طريق النشاف المناعي ، سواء المستخلص المستنفد أو الخرز.

نظرا لأن T والتدهور يعتمد على الطاقة ، فإنه يستنفد بسرعة مخازن A TP الذاتية. وبالتالي ، من أجل الحفاظ على تدهور T القوي ، يجب عليك استخدام مزيج تجديد الطاقة. قم بإعداد تجديد الطاقة 20 × مزيج ER كما هو مفصل في بروتوكول النص.

قم بإذابة مستخلص بيض التأليف بسرعة عن طريق فرك الأنبوب المجمد بين اليدين. ضع الأنبوب على الثلج قبل ذوبان كل المستخلص. أضف 10 ميكرولتر من تجديد الطاقة.

تخلط مع كمية من مستخلص بيض xenopus. تخلط جيدا عن طريق تحريك الأنبوب بسرعة ودوران نبض النبض ، ثم ضعها على الفور على الثلج. Aliquot الأحجام المناسبة لمقايسة التحلل إلى أنابيب fuge الدقيقة المبردة مسبقا على الجليد.

للتحضير لمقايسات بيتا كاتين والتحلل المسمى بالراديو ، اسحب ليلترين إلى خمسة ميكرولتر من المستخلص لكل نقطة زمنية لإجراء اختبار تحلل بيتا كاتينين المسمى بالراديو في مستخلص بيض XUS. أولا ، قم بإعداد الراديو المسمى بيتا كاتينين كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم أضف واحدا إلى ثلاثة ميكرولترات من بيتا كاتينين المترجم في المختبر إلى 20 ميكرولترا من مزيج تفاعل xip على مزيج الثلج جيدا عن طريق النقر السريع للأنبوب ونبضة قصيرة من الدوامة.

هذه خطوة مهمة. مستخلص بيض XUS لزج للغاية وسيؤثر الخلط غير المكتمل على تناسق نتائج النبض والدوران ووضعها على الجليد. ابدأ تفاعل تحلل بيتا كاتينين عن طريق تحويل الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة في النقطة الزمنية المحددة.

قم بإزالة واحد إلى خمسة ميكرولتر من العينة واخلطها على الفور مع خمسة أضعاف حجم من المخزن المؤقت لعينة SDS لإيقاف التفاعل للتأكد من إنهاء تفاعل التحلل تماما. انقر فوق الأنبوب عدة مرات ودوامة بقوة لأداء صفحة SDS. يقوم التصوير الشعاعي التلقائي بتشغيل ما يعادل ميكرولتر واحد من المستخلص لكل نقطة زمنية لكل حارة.

يمكن تحديد النتائج كميا باستخدام الصورة أو J image quant أو أي برنامج تصوير مفضل آخر. يجب أن يتضح تدهور بيتا كاتينين في مستخلص بيض xap من خلال الانخفاض المعتمد على الوقت في شدة الراديو المسمى بيتا كين في النطاق. لتحضير بيتا كاتينين لوسيفيراز ، قم بتوليف لوسيفيراز غير مصنف بالإشعاع الموسومة بيتا كاتينين.

استخدام نظام ترجمة النسخ المقترن بمزيج كامل من الأحماض الأمينية. تأكد من إنتاج لوسيفيراز الموسوم بيتا كاتينين عن طريق قياس نشاط لوسيفيراز من 0.5 إلى ميكرولتر واحد من التفاعل. قم بتقييم تلألؤ الخلفية عن طريق قياس اللمعان من مزيج تفاعل غير مترجم لإجراء مقايسة تحلل بيتا كاتين لوسيفيراز أولا وإعداد مستخلص بيض xenopus كما كان من قبل.

ثم أضف اندماج بيتا كاتين ولوسيفيراز المترجم في المختبر إلى تفاعل xip المحضر. تخلط على الثلج وتخلط جيدا. كما كان من قبل ، قم بتحويل المستخلص إلى درجة حرارة الغرفة لبدء تفاعل التحلل.

قم بإزالة حصة من التفاعل عند النقطة الزمنية المحددة وقم بالتجميد في النيتروجين السائل. قم بإزالة العينات الثلاثية لتحليلها في كل نقطة زمنية. يمكن تخزين المستخلص المجمد عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للتحليل.

قم بإذابة العينات على الجليد وانقل العينات إلى ألواح بئر بيضاء 96 قياسية على الجليد قبل المعالجة. بالنسبة لنشاط لوسيفيراز ، يمكن إثبات التحلل المعتمد الثالث ل GS GSK لبيتا كاتينين بسهولة بطرق متعددة باستخدام مستخلص بيض XUS. يتم تثبيط تدهور راديو S 35 المسمى بيتا كاتينين في مستخلص XUS عن طريق إضافة مثبط البروتيازوم MG 1 32.

يتم تثبيت طفرة بيتا كاتينين في مستخلص البيض XUS بالنسبة إلى البيتين من النوع البري ومثبطات البروتين في GSK ثلاثة تمنع بالمثل تحلل بيتا كاتينين. أخيرا ، يمكن إنقاذ استنفاد GSK three من مستخلص البيض xip تحلل تحلل بيتا كاتينين عن طريق إضافة GSK الثالث ثلاثة. تم استخدام مقايسة تحلل بيتا كاتينين لوسيفيراز في مستخلص البيض xip لتقييم تحلل بيتا كاتين ولوسيفيراز.

يشبه معدل تدهور بيتا كاتين ولوسيفيراز بروتين بيتا كاتينين غير الموسوم. يتطابق تنظيم التحلل لاندماج بيتا كاتين ولوسيفيراز بشكل أساسي مع البروتين غير الاندماجي. حيث أدت إضافة كلوريد الليثيوم إلى تثبيط تغيرات دوران بيتا كاتين ولوسيفيراز في الإشارة المشعة لبيتا كاتينا.

يوازي بروتين لوسيفيراز التغيرات في النشاط الأنزيمي لوسيفيراز بمرور الوقت أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم الاحتفاظ بجميع الكواشف على الجليد وخلط التفاعلات جيدا قبل محاولة هذا الفحص. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد المنظمين وتحليل بيتا كاتين ودورانها باستخدام نظام استخراج بيض xenopus الخالي من الخلايا.