RNAscope ل في الوضع الطبيعي الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري بالموقع Transcriptionally في الرأس والرقبة سرطان الخلايا الحرشفية

الهدف العام من التجربة التالية هو إثبات الاكتشاف الحساس والمحدد لفيروس الورم الحليمي البشري عالي الخطورة ستة ، E سبعة mRNA في الخلايا السرطانية في سرطانات الرأس والرقبة باستخدام تقنية تهجين جديدة للحمض النووي الريبي في الموقع تسمى نطاق الحمض النووي الريبي. يتم تحقيق ذلك عن طريق المعالجة المسبقة أولا ، عينات الأنسجة على الشرائح بالحرارة والبروتياز لاختراق الخلايا للسماح بالوصول إلى المسبار. كخطوة ثانية ، احتضن الشرائح مع كوكتيل مسبار فيروس الورم الحليمي البشري الذي يستهدف سبعة أنواع عالية الخطورة من فيروس الورم الحليمي البشري ، والذي يهجن إلى E ستة E سبعة mRNA.

بعد ذلك ، قم بتضخيم إشارات التهجين عن طريق التهجين بالتتابع باستخدام مكبر الصوت المسبق ومسبار الملصق المترافق HRP. ثم يتم الكشف عن الإشارة باستخدام كروموجين ويتم تصورها في ظل نتائج الفحص المجهري القياسي للحقل الساطع التي تظهر HPVE ستة E سبع إشارات mRNA على أنها رواسب بنية مثقبة في أورام فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية ، ولكن ليس في الأورام السلبية لفيروس الورم الحليمي البشري. يستخدم مقايسة نطاق RRA استراتيجية تصميم مسبار جديدة ومملوكة لتهجين الحشرات.

يسمح بتصور جزيء واحد وتحديد الهدف. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث المؤشرات الحيوية وتطوير الحمض التشخيصي لتحديد والتحقق من صحة أي مؤشرات حيوية للحمض النووي الريبي تم اكتشافها من خلال دراسات السباق الكلي أو الجيل التالي من التسلسل. يمكن لمعظم العلماء الذين لديهم خبرة سابقة في IHC أو كل منهم التقاط هذه الطريقة بسرعة.

سأقدم لك الآن عرضا توضيحيا لسير العمل بأكمله مع تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية لمساعدتك على إتقان التقنية. عينات الأنسجة التي سيتم فحصها بواسطة تقنية التهجين في الموقع من الحمض النووي الريبي رسمية وثابتة. أقسام البارافين المدمجة بسمك خمسة زائد أو ناقص ميكرون واحد مثبتة على الشرائح قبل ساعة واحدة من الفحص.

تخبز الشرائح في فرن جاف على حرارة 60 درجة مئوية أثناء خبز الشرائح. تحضير فرن التهجين. ارفع درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية وضع ورق ترطيب في درج التحكم في الرطوبة.

أضف 50 مل من الماء المقطر إلى ورق الترطيب لترطيبه تماما. أدخل الصينية المغطاة في الفرن للتدفئة المسبقة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تحضير 700 مل من محلول واحد × معالجة مسبقة عن طريق تخفيف 10 × محلول المعالجة المسبقة في الماء المقطر.

قم بتسخين محلول واحد × معالجة مسبق للغليان والحفاظ على درجة الحرارة بين 100 و 104 درجة مئوية. مع منع الإفراط في الغليان. اصنع ثلاثة لترات من مخزن غسيل واحد عن طريق تخفيف مخزن الغسيل المسبق للتدفئة 50 × في الماء المقطر تحت غطاء الدخان.

تحضير الزيلين و 70٪ الإيثانول و 100٪ الإيثانول لإنهاء التجفيف والجفاف. تحضير محلول تلطيخ الهيماتين بنسبة 50٪ و 0.01٪ ماء الأمونيا أو كاشف الأزرق لتلوين ما بعد التلوين. قم بتسخين المجسات المستهدفة عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

أحضر جميع كواشف مجموعة الكشف عن RTU باستثناء DAB chromogen brown A و brown B إلى درجة حرارة الغرفة. لبدء هذا الفحص de تقسيم أقسام الأنسجة المخبوزة في الزيلين مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة مع التحريض المتكرر. يجفف في 100٪ إيثانول مرتين لمدة ثلاث دقائق لكل منهما مع التحريض المتكرر.

جفف في الهواء لمدة خمس دقائق ثم ارسم حاجزا مسعورا حول قسم الأنسجة باستخدام قلم الحاجز الكارهة للماء. ابدأ المعالجة المسبقة لأقسام الأنسجة عن طريق احتضانها بمحلول واحد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سيؤدي ذلك إلى إخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي.

اشطفه بالماء المقطر. بعد ذلك ، استرجع الحمض النووي الريبي عن طريق احتضان أقسام الأنسجة لمدة 15 دقيقة مع المعالجة المسبقة ، ومحلولين يتم الاحتفاظ بهما عند درجة حرارة الغليان بعد 15 دقيقة ، وشطفهما مرتين في الماء المقطر لهضم البروتين. عالج أقسام الأنسجة بثلاثة محلول معالج مسبقا واحتضانها في فرن التهجين على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

عند الانتهاء من الحضانة لمدة 30 دقيقة ، اشطف أقسام الأنسجة مرتين في الماء المقطر. الخطوة التالية هي تهجين المسبار المستهدف باستخدام مجموعة من المجسات التي تكتشف E ستة E سبعة mRNA من سبعة أنماط وراثية عالية الخطورة من فيروس الورم الحليمي البشري HPV 16 و 18 و 31 و 33 و 35 و 52 و 58. أضف مجسات فيروس الورم الحليمي البشري ومسبار يوبيكويتين سي ومسبار الجين البكتيري DAP B بشكل منفصل على ثلاثة أقسام متجاورة للنسيجة.

تهجين على حرارة 40 درجة مئوية في الفرن لمدة ساعتين في نهاية الحضانة لمدة ساعتين. اشطف أقسام المناديل في محلول الغسيل مرتين لمدة دقيقتين في كل مرة في درجة حرارة الغرفة لتضخيم الإشارة. ابدأ باحتضان أقسام الأنسجة باستخدام مكبر الصوت المسبق AMP لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين.

اشطفها مرتين في محلول الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. تتضمن الخطوات اللاحقة لتضخيم الإشارة احتضان أقسام الأنسجة بالكواشف التالية عند 40 درجة مئوية للفترة الزمنية المحددة مع شطفتين في مخزن الغسيل في درجة حرارة الغرفة. بعد كل حضانة ، قم بعمل مخفض خلفية AMP لمدة 15 دقيقة.

AMP بثلاثة مكبر للصوت لمدة 30 دقيقة ومسبار AMP بأربعة مسبار لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم باحتضان أقسام الأنسجة بأمبير خمسة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الشطفين في محلول الغسيل ، واحتضانها بأمبير ستة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بشطفتين أخريين في محلول الغسيل. للكشف عن الإشارة ، اصنع خليطا واحدا لواحد DAB عن طريق خلط كميات متساوية من البني A والبني B ، أضف المحلول إلى الشرائح واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اشطفها مرتين بالماء المقطر. قم بتغطية بقع أقسام الأنسجة بمحلول هيمات 50٪ لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ثم اشطفها بالماء المقطر حتى تصبح الشرائح صافية بينما تبقى الأنسجة. ينزلق الغمس الأرجواني في 0.01٪ ماء الأمونيا خمس مرات متبوعا بخمس غموسات والماء المقطر يجفف أقسام الأنسجة عن طريق الحضانة لمدة دقيقتين لكل منها 70٪ إيثانول و 100٪ إيثانول و 100٪ إيثانول ، يليه الزيلين لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، قم بتركيب الشرائح باستخدام وسائط التثبيت القائمة على الزيلين المعروضة فيما يلي أمثلة على الصور من أقسام البارافين المضمنة الملطخة الرسمية والثابتة من خلية الحرشفية للرأس والرقبة Sonoma. في الحالة الإيجابية لفيروس الورم الحليمي البشري ، اكتشفت مجسات فيروس الورم الحليمي البشري إشارات ثقب قوية على وجه التحديد في الخلايا السرطانية. يتم تصور هذا بوضوح في الجزء الداخلي عند تكبير 40 ×.

مسبار UBC للتحكم الإيجابي العديد من الإشارات السيتوبلازمية المثقوبة في كل من الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية. بينما أظهر مسبار التحكم السلبي DAP B خلفية نظيفة في الحالة السلبية لفيروس الورم الحليمي البشري ، لم يكتشف كل من مسبار HR HPV ومسبار DAP B أي إشارات ، تم اكتشاف إشارات قوية بواسطة مسبار UBC. يتضمن تسجيل تحديد حالة فيروس الورم الحليمي البشري فحص الشرائح الثلاث لكل حالة.

يتم استخدام مستوى التلوين على شريحة التحكم السلبي DAP B حيث يتم تحديد إيجابية فيروس الورم الحليمي البشري من خلال وجود تلطيخ نقطي أو سيتوبلازمي و / أو نووي فوق الإشارة على شريحة DAP B. يمكن إكمال مقايسة نطاق الحمض النووي الريبي في غضون ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء إجراء الفحص. من الأهمية بمكان إضافة كمية كافية من المحلول لتغطية منطقة الأنسجة بأكملها في كل خطوة.

من المهم أيضا إزالة أي مخزن مؤقت متبقي عن طريق تحريك الشرائح بين الخطوات ، مع الحفاظ على الشرائح بيضاء. يمكن تطبيق تقنية إعادة المنظار للكشف عن أي مؤشرات حيوية للحمض النووي الريبي بشكل أساسي في أي خلية أو نسيج من أي نوع.