RNAscope ل

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح الكشف الحساس والنوعي عن mRNA الخاص بـ E six وE seven لفيروس HPV عالي الخطورة في الخلايا الورمية في سرطانات الرأس والعنق، وذلك باستخدام تقنية حديثة للتهجين الموضعي للحمض النووي الريبي تُسمى RNA scope. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق المعالجة المسبقة لعينات الأنسجة الموجودة على الشرائح باستخدام الحرارة والبروتياز لنفاذ الخلايا بما يسمح بوصول المسبار. وكخطوة ثانية، تُحضن الشرائح مع مزيج من مسابير HPV التي تستهدف سبعة أنواع من HPV عالي الخطورة، والتي تتهجن مع mRNA الخاص بـ E six وE seven.

بعد ذلك، قم بتضخيم إشارات التهجين عن طريق التهجين المتسلسل باستخدام المضخم الأولي والمضخم ومسبار الوسم المقترن بـ HRP. ثم يتم الكشف عن الإشارة باستخدام مادة مولدة للون ويتم تصورها تحت مجهر الحقل المضيء القياسي، حيث يتم الحصول على نتائج تظهر إشارات mRNA لـ HPVE six E seven على شكل رواسب بنية نقطية في الأورام الإيجابية لـ HPV، ولكن ليس في الأورام السلبية لـ HPV. يستخدم مقايسة RRA scope استراتيجية تصميم مسابر مبتكرة ومملوكة لضمان دقة التهجين.

تتيح هذه التقنية تصور الجزيء المنفرد وقياس كمية الهدف. ويمهد هذا التطور الطريق للباحثين في مجال أبحاث المؤشرات الحيوية وتطوير assays التشخيصية لتحديد والتحقق من صحة أي مؤشرات حيوية لـ RNA يتم اكتشافها من خلال دراسات macro race أو تسلسل الجيل التالي. ويمكن لمعظم العلماء الذين لديهم خبرة سابقة في IHC أو FISH إتقان هذه الطريقة بسرعة.

سأقدم لكم الآن عرضاً توضيحياً لسير العمل كاملاً مع تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية لمساعدتكم في إتقان هذه التقنية. إن عينات الأنسجة المقرر فحصها باستخدام تقنية التهجين الموضعي لـ RNA هي عينات مثبتة بالفورمالين. يتم تثبيت مقاطع مغمورة في البارافين بسُمك 5 ± 1 ميكرون على شرائح زجاجية قبل ساعة واحدة من بدء الفحص.

قم بتجفيف الشرائح في فرن جاف عند 60 درجة مئوية. وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز فرن التهجين؛ حيث يتم ضبط درجة الحرارة على 40 درجة مئوية ووضع ورقة ترطيب في صينية التحكم في الرطوبة.

أضف 50 milliliters من الماء المقطر إلى ورق الترطيب لترطيبه بالكامل. أدخل الصينية المغطاة في الفرن للتسخين المسبق لمدة 30 minutes على الأقل قبل الاستخدام. حضّر 700 milliliters من محلول pretreat two بتخفيف 10 x pretreatment solution في الماء المقطر.

سخن محلول pretreat two بتركيز 1x حتى الغليان وحافظ على درجة الحرارة بين 100 و 104 °C، مع تجنب الغليان المفرط. قم بتحضير 3 L من محلول wash buffer بتركيز 1x عن طريق تخفيف محلول wash buffer بتركيز 50x المسخن مسبقاً في ماء مقطر تحت خزانة استخلاص الأدخنة.

قم بتحضير الزايلينات، والإيثانول بتركيز 70%، والإيثانول بتركيز 100% لإتمام عملية إزالة الشمع والتجفيف. قم بتحضير محلول صبغة الهيماتين بتركيز 50%، ومحلول أمونيا بتركيز 0.01% أو كاشف التزريق لما بعد الصبغ. قم بتدفئة المسابير المستهدفة مسبقاً عند درجة حرارة 40 °C لمدة 10 دقائق.

اترك جميع كواشف مجموعة الكشف الجاهزة للاستخدام (RTU) لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، باستثناء صبغة DAB البنية A والبنية B. لبدء هذا المقايسة، قم بإزالة البارافين من قطاعات الأنسجة المثبتة في الزايلين مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة مع الرج المتكرر. ثم قم بإزالة الماء باستخدام الإيثانول بتركيز 100% مرتين لمدة ثلاث دقائق في كل مرة مع الرج المتكرر.

يُترك النسيج ليجف في الهواء لمدة خمس دقائق، ثم تُرسم حدود مانعة للماء حول مقطع النسيج باستخدام قلم الحاجز الكاره للماء. يبدأ المعالجة المسبقة لمقاطع النسيج بحضنها في محلول المعالجة المسبقة الأول (pretreat one solution) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ وذلك لإخماد نشاط بيروكسيديز الداخلي.

اشطف في الماء المقطر. بعد ذلك، يتم استخلاص RNA عن طريق تحضين مقاطع الأنسجة لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول المعالجة المسبقة الثاني، مع الحفاظ على درجة حرارة الغليان لمدة 15 دقيقة، ثم اشطف مرتين في الماء المقطر لهضم البروتين. عالج مقاطع الأنسجة بمحلول المعالجة المسبقة الثالث وحضنها في فرن التهجين عند 40 °C لمدة 30 دقيقة.

عند انتهاء فترة الحضن التي تستغرق 30 دقيقة، اشطف مقاطع النسيج مرتين بالماء المقطر. الخطوة التالية هي تهجين المسبار المستهدف باستخدام مجموعة من المسابير التي تكشف عن mRNA لـ E6 و E7 لسبعة أنماط جينية من فيروس HPV عالي المخاطر، وهي HPV 16 و 18 و 31 و 33 و 35 و 52 و 58. أضف مسابير HPV، ومسبار ubiquitin C، ومسبار الجين البكتيري DAP B بشكل منفصل على ثلاثة مقاطع نسيجية متجاورة.

قم بإجراء التهجين عند 40 °C في الفرن لمدة ساعتين في نهاية فترة الحضانة التي استمرت ساعتين. اغسل مقاطع الأنسجة في محلول الغسيل مرتين لمدة دقيقتين في كل مرة في درجة حرارة الغرفة لتضخيم الإشارة. ابدأ بحضانة مقاطع الأنسجة مع مضخم AMP one الأولي لمدة 30 دقيقة عند 40 °C في فرن التهجين.

اشطف مرتين في محلول الغسيل لمدة دقيقتين في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. تتضمن الخطوات اللاحقة لتضخيم الإشارة تحضين مقاطع النسيج مع الكواشف التالية عند 40 درجة مئوية للمدة المحددة مع شطفين في محلول الغسيل في درجة حرارة الغرفة. بعد كل تحضين، استخدم AMP two background reducer لمدة 15 دقيقة.

يتم التحضين باستخدام المضخم AMP three لمدة 30 دقيقة، ثم باستخدام المسبار المسمى AMP four لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تُحضن قطاعات النسيج مع amp five لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد غسلها مرتين بمحلول الغسيل، ثم تُحضن مع amp six لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يتبع ذلك غسلتان إضافيتان بمحلول الغسيل. ولكشف الإشارة، يتم تحضير خليط DAB بنسبة واحد إلى واحد عن طريق خلط أحجام متساوية من brown A و brown B. يُضاف المحلول إلى الشرائح وتُحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اشطف العينات مرتين بالماء المقطر. قم بصبغ المقاطع النسيجية بصبغة تباينية باستخدام محلول hematoin بتركيز 50% لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم اشطفها بالماء المقطر حتى تصبح الشرائح صافية بينما تظل الأنسجة باللون الأرجواني. اغمس الشرائح في ماء الأمونيا بتركيز 0.01% خمس مرات، متبوعة بخمس غمسات في الماء المقطر. قم بإزالة الماء من المقاطع النسيجية عن طريق تحضينها لمدة دقيقتين في كل من الإيثانول بتركيز 70%، والإيثانول بتركيز 100%، والإيثانول بتركيز 100%، متبوعة بالزيلين لمدة خمس دقائق.

أخيراً، قم بتثبيت الشرائح باستخدام وسط تثبيت قائم على الزايلين الموضح هنا. تظهر هذه الصور أمثلة لمقاطع من نسيج مثبت بالفورمالين ومطمور في البارافين من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والعنق. في الحالة الإيجابية لفيروس HPV، اكتشفت مجسات HR HPV إشارات نقطية قوية تحديداً في الخلايا الورمية. وهذا يتضح بجلاء في الصورة المدرجة عند تكبير 40 x.

كشف مسبار UBC (الضابط الموجب) عن العديد من الإشارات السيتوبلازمية النقطية في كل من الخلايا الورمية والخلايا السدوية. وبينما أظهر مسبار DAP B (الضابط السالب) خلفية نظيفة في الحالة السلبية لـ HPV، لم يكتشف كل من مسبار HR HPV ومسبار DAP B أي إشارات، في حين اكتشف مسبار UBC إشارات قوية. ويتضمن تسجيل تحديد حالة HPV فحص الشرائح الثلاث جميعها لكل حالة.

يُستخدم مستوى الصبغ في شريحة التحكم السلبي DAP B كحد فاصل، حيث يتم تعريف إيجابية HPV بوجود صبغ نقطي في السيتوبلازم و/أو النواة يتجاوز مستوى الإشارة في شريحة DAP B. يمكن إكمال مقايسة RNA scope في غضون ثماني ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح أثناء إجراء المقايسة. ومن الضروري إضافة كمية كافية من المحلول لتغطية منطقة النسيج بالكامل في كل خطوة.

ومن المهم أيضاً إزالة أي محلول منظم متبقٍ عن طريق نقر الشرائح بين الخطوات، مع الحفاظ على لون الشرائح أبيض. ويمكن تطبيق تقنية rescope للكشف عن أي من المؤشرات الحيوية لـ RNA بشكل أساسي في أي خلية أو نسيج لأي نوع من الكائنات.