بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس محتوى الدهون المحايد لخلايا الطحالب باستخدام صبغة الفلورسنت الأحمر النيلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعليق الخلايا أولا في محلول الإيثانول لاختراق جدار الخلية وغشاء الخلية. كخطوة ثانية ، تضاف صبغة الفلورسنت الحمراء النيلية ، والتي تدخل الخلايا وتتراكم في المناطق غير القطبية للخلية ، بما في ذلك الأجسام الدهنية المحايدة.

بعد ذلك ، تتعرض العينات لمصدر ضوء إثارة يبلغ 530 نانومتر ، مما يتسبب في امتصاص أحمر النيل في الأجسام الدهنية المحايدة للتألق عند 604 نانومتر. يتم الحصول على النتائج على نطاق واسع عن طريق إجراء الاختبارات الفردية في بئر صغير مضاعف واستخدام مقياس الطيف الضوئي لإنتاج قراءات مضان سريعة. تظهر القراءات علاقة خطية بين المحتوى الدهني المحايد لخلايا الطحالب وشدة قياس الفلورة.

يمكن تحويل قياسات التألق إلى محتوى الزيت من خلال منحنى معايرة معد بخلايا ذات تركيبة زيت معروفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على البروتوكولات الحالية ، مثل طريقة القياس الوزني اللاعي Bly ، هي أنها تسمح بالتحديد السريع لمحتوى الدهون المحايدة باستخدام المواد المتاحة لمعظم المختبرات. توفر هذه الطريقة ملاحظات فورية حول أداء العملية الحيوية أثناء زراعة الطحالب.

أيضا ، فإن الإنتاجية العالية التي يسمح بها قارئ لوحة 96 Well مثالية لدراسات الفحص والتجارب العاملة. على الرغم من أن هذه التقنية قد تم تحسينها من أجل الكلوريلا و s Desus ، إلا أنه يمكن تعديلها بسهولة لتحليل أنواع الطحالب الأخرى. حسنًا. للبدء ، قم بإزالة حجم العينة من ثقافة الطحالب المتنامية التي ستوفر ما لا يقل عن 200 ملليغرام من الكتلة الحيوية الجافة.

يفضل 400 إلى 600 ملليغرام. الطرد المركزي للعينة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 10،000 مرة. G ، تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بحجم متساو من مخزن الفوسفات المكون بنفس درجة الحموضة مثل وسط النمو.

كرر هذه العملية لما مجموعه ثلاث خطوات غسيل. أعد تعليق الحبيبات في ماء منزوع الأيونات وانقلها إلى طبق وزن مسبق. دع العينة تجف عند 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

يمكن تخزين مزارع الطحالب المجففة في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في المستقبل. قم بقياس ما يقرب من 50 ملليغرام من الكتلة الحيوية للطحالب الجافة في طبق مصل اللبن. انقل الكتلة الحيوية إلى ملاط مغسول مسبقا بالهكسان إذا لزم الأمر ، واغسل طبق مصل اللبن بكمية صغيرة من الهكسان باستخدام ماصة سابقة لنقل الكتلة الحيوية بالكامل إلى ترتيب الملاط.

بعد ذلك ، قم بطحن الكتلة الحيوية للطحالب لمدة خمس دقائق باستخدام مدقة. ابدأ بطحن لطيف وقم بزيادة الكثافة تدريجيا. طحن الكتلة الحيوية إلى عجينة ناعمة وسلسة.

خلال فترة الخمس دقائق ، أضف بضعة ملليلتر من الهكسان إلى الملاط واخلط الملاط الناتج مع المدقة حتى يتجانس. تأكد من أن جميع بقايا الخلية الملتصقة بجدران الملاط قد تم التخلص منها وتعليقها في السائل. بعد ذلك ، انقل خليط كتلة خلية الهكسان إلى أنبوب طرد مركزي متوافق.

كرر ثلاث إلى خمس مرات حتى يتم نقل كل الكتلة الحيوية إلى أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي للعينة عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة عند 10،000 مرة. G. بعد الطرد المركزي ، قم بعمل ماصة طافية بعناية في طبق معدني موزون مسبقا ، والذي يمكن تخزينه في غطاء الدخان.

قم بإجراء استخراج الهكسان الثاني عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من الهكسان إلى الحبيبات والدوامة بقوة. لمدة دقيقة واحدة ، كرر الطرد المركزي ونقل المادة الطافية. تحديد كتلة الزيت المستخرج بالقياس الوزني بعد تبخر الهكسان تماما.

لقياس الكمية المترية بالفلورو ، قم بإعداد جميع عينات الطحالب بنفس تركيز الكتلة الحيوية وبنفس طريقة المعايير المستخدمة في القياس. افعل ذلك عن طريق تعليق العينات المجففة مسبقا في الكمية المناسبة من مخزن الفوسفات. إذا لزم الأمر ، استخدم الخالط لتسهيل تعليق إعادة التركيب لخلايا الطحالب المجففة.

لكل عينة ، امزج 80 ميكرولترا من محلول الإيثانول المحضر بنسبة 30٪ ، و 10 ميكرولتر من محلول أحمر النيل المحضر و 10 ميكرولتر من تعليق الطحالب في بئر واحد من لوح 96 بئر. من أجل حساب تباين قياس التألق بشكل صحيح ، قم بإجراء خمس تكرارات لكل عينة. بعد ذلك ، قم بتشغيل منحنى معايرة من نقطتين مع المعايير المعدة مسبقا.

من أجل حساب الاختلافات اليومية في الجهاز والتحضير لإجراء قياسات التألق في مقياس الطيف الضوئي لقارئ الألواح متعدد الآبار ، اضبط المعلمات على الاهتزاز عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة وتدور حول ثلاثة ملليمترات لمدة 30 ثانية ، تليها الحضانة عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اهتزاز آخر عند 1 ، 200 دورة في الدقيقة ومدار ثلاثة ملليمترات لمدة 30 ثانية ، ولتسجيل التألق مع الإثارة عند 530 نانومتر والانبعاث عند 604 نانومتر. ثم ابدأ الجري كخطوة أخيرة.

تحويل قياسات التألق إلى محتوى الزيت باستخدام نتائج المعايير الداخلية لإجراء الفحص المجهري الفلوري. استخدم العينة المحضرة بصبغة النيل الحمراء لإعداد شريحة مجهرية لعينة العملية وفقا للإجراءات المعملية القياسية. بدءا من المجهر في وضع الإرسال ، قم بتحميل الشريحة المعدة في المجهر وحدد موقع الخلايا بالتكبير المطلوب.

بمجرد التركيز ، قم بتبديل المجهر من وضع الإرسال إلى وضع إضاءة مضان epi. يجب أن يأتي مصدر الضوء الآن مباشرة من العدسة الموضوعية ، والتي يمكن تأكيدها بصريا من خلال مراقبة المسافة بين الشريحة والعدسة الموضوعية. أدخل مرشح إثارة أخضر في مصدر الضوء ومرشح انبعاث أحمر في مسار ضوء المراقبة.

يجب أن يكون مضان الخلايا الملطخة مرئيا الآن مباشرة من خلال العدسة. قم بتبديل وضع مراقبة المجهر من العدسة إلى الكاميرا المثبتة واستخدم برنامج العرض لالتقاط صورة للخلايا الفلورية. ستختلف الإعدادات المحددة باختلاف الأدوات والمعدات وأنواع الخلايا.

تظهر صور لخلايا الطحالب التمثيلية الملطخة بصبغة النيل الحمراء لبروث ينمو في النيتروجين الزائد يؤدي إلى تراكم منخفض جدا للدهون داخل الخلايا ، والتي تظهر على عكس عينات من OIDs المزروعة تحت قيود النيتروجين. تحت إضاءة الإرسال ، يمكن تصور الأجسام الدهنية للخلايا من خلال الفحص الدقيق حيث تظهر كهياكل دائرية لامعة وتشكل غالبية حجم الخلية. الخلايا الموضحة هنا هي 5٪ فقط من الزيت بالوزن الجاف ولا تحتوي على مستويات كبيرة من الأجسام الدهنية عند إظهار ظروف الإضاءة المناسبة.

يتم تضخيم الاختلافات في هذه العينات. تظهر الخلايا الخالية من الدهون على شكل حلقات فلورية ذات أجسام داكنة ، بينما تظهر الخلايا الغنية بالزيت توهجا أحمر برتقاليا ساطعا حيث تراكمت فيها أجساما دهنية. سوف يتألق النيل الأحمر بأطوال موجية مختلفة اعتمادا على وجود الدهون المحايدة والفوسفوليبيدات الموجودة على جدار الخلية والبروتينات الخلوية غير القطبية ، وهذا هو السبب في ظهور الخلايا الخالية من الدهون على شكل حلقات فلورية ذات أجسام داكنة.

هذه الخصوصية غير النوعية هي أيضا ما يسبب مستوى الخلفية للتألق أثناء قياسات مقياس الطيف الضوئي للدهون المحايدة في ظل الظروف المثلى للفحص ، ويمكن تحقيق منحنيات المعايرة ذات القيم المربعة R الأكبر من 0.980 بسهولة. تصبح العلاقة بين محتوى زيت الخلية والمضان غير خطية إذا كانت الخلايا ملطخة بمحلول ، تفتقر إلى مذيب ناقل مثل الإيثانول. تحتوي البيانات المعروضة هنا على مربع R يبلغ 0.395 ، وتم الحصول عليها من خلال تنفيذ البروتوكول في محلول إيثانول 0٪.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 15 إلى 20 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من الأهمية بمكان التأكد من تحضير جميع العينات بنفس تركيز الكتلة الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس محتوى الدهون المحايد لخلايا الطحالب باستخدام كل من بروتوكولات استخراج الهكسان التقليدية وإجراء تلطيخ الفلورسنت الأحمر الأبسط NAL.