عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل RNA عالي الجودة من عينات المصل، وذلك باستخدام نسختنا المحسنة من بروتوكول كاشف RTLS الشائع من MRC. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تخفيف المصل بنسبة واحد إلى خمسة باستخدام ماء خالٍ من النوكلياز لتقليل التلوث البروتيني.

تتمثل الخطوة الثانية في استخدام أنابيب Phase Lock سعة 2 mL لخطوة الطرد المركزي الأولى، وذلك لاحتجاز أغلب الملوثات، مثل الفينول والبروتينات في الطور العضوي. بعد ذلك، تكون خطوة التحسين الثالثة والأخيرة هي إجراء عملية طرد مركزي سريعة عند 12,000 g، لإزالة أي تلوث متبقٍ من كريّة RNA قبل عمليات الغسل بالإيثانول.

تتمثل الخطوة النهائية في تجميع تحضيرين من RNA المعدل من المريض نفسه في حال كانت هناك حاجة إلى زيادة إجمالي حصيلة RNA. وفي النهاية، ومن خلال استخدام هذه الطريقة المعدلة، التي تذيب المصل في ماء خالٍ من النوكلييز وتستخدم أنبوب قفل طوري (phase lock tube) لاحتجاز الملوثات الرئيسية وتتضمن عملية دوران سريع (flash spin)، فإننا نبين إمكانية تحقيق أقصى قدر من استعادة جزيئات RNA الصغيرة غير المشفرة عند عزل RNA من المصل.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل بروتوكول عزل RNA القياسي باستخدام التريول (triol)، في أنه يمكننا من خلال تعديلات بسيطة تحقيق أقصى قدر من إنتاجية RNA من المصل. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن جزيئات RNA الصغيرة توجد بكميات منخفضة في المصل. لذا، فإن الطريقة المُحسّنة والعرض المرئي لهذه الخطوات سيعملان على تحسين استعادة جزيئات RNA هذه وتوجيه المبتدئين لإتمام عملية العزل بنجاح.

للبدء، قم بإذابة عينة المصل المجمدة والمعدة مسبقاً على الثلج، ثم انقل 400 µL من المصل المذاب حديثاً إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مُصنف. بعد ذلك، خفف المصل بإضافة 100 µL من الماء الخالي من RNase وأضف 50 µL من البروتينيز K بتركيز 1 mg/mL. ثم قم بحضن المصل المخفف عند 37 °C لمدة 20 دقيقة للسماح بهضم البروتين بشكل كافٍ لضمان الذوبان الكامل في 1.5 mL من كاشف TRI reagent RTLS و 100 µL من four promo anole.

اقلب المتجانس لفترة وجيزة وقم بعملية السحب والضخ المتكرر باستخدام الماصة لمدة خمس ثوانٍ. ثم انقل الخليط إلى أنبوب heavy phase lock سعة 2 mL مصنف. قم بطرد المتجانس مركزياً بسرعة 12,000 GS لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، قم بسكب 1 mL من المحلول المائي الناتج بعناية في أنبوب جديد منخفض الارتباط بـ DNA. يجب أن تظل الطبقة العضوية والطبقة البينية محتجزة تحت الجل الأبيض لأنبوب قفل الطور (phase lock tube). ثم أضف 5 µL من الجليكوجين و 500 µL من الإيزوبروبانول بتركيز 100% إلى المحلول المائي.

اخلط المحلول عن طريق القلْبِ وحضنه طوال الليل عند -20 °C. وبعد التحضين طوال الليل، قم بطرد العينة مركزياً لمدة 20 دقيقة عند 12,000 g في جهاز طرد مركزي عند 4 °C. بعد ذلك، تخلص من الرائق الشفاف وقم بإجراء عملية تدوير سريع (flash spin) لمدة دقيقتين عند 16,000 g في جهاز طرد مركزي عند 4 °C.

باستخدام ماصة، قم بإزالة المحلول الشفاف المحيط بالراسب بعناية. بعد ذلك، اغسل الراسب بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 70% وقم بطرد العينة مركزياً عند 10,000 GS لمدة 10 دقائق. ولرؤية الراسب، أَمِل الأنبوب أمام خلفية داكنة ثم قم بتفريغ محلول الغسيل.

كرر عملية الغسل. انتقل للخطوة التالية. نقوم بتعليق الراسب في 10 µL من الماء الخالي من RNA.

تأكد من ذوبان الراسبة تماماً عن طريق تسخين العينة عند 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. خلال هذا الوقت، امزج العينة عن طريق السحب والضخ المتكرر بالممصّة للحصول على تجمع أعلى من عائد RNA الكلي، من تحضيرين لـ RNA من المريض نفسه. قم بقياس كمية RNA المعاد تعليقه باستخدام الأشعة فوق البنفسجية UV.

جهاز مقياس الطيف الضوئي، وتقييم جودة RNA باستخدام 2100 bioanalyzer. ثم تُخزن عينات RNA المجمعة عند درجة حرارة -80 °C لاستخدامها في التطبيقات اللاحقة. وتظهر مقاطع قياس الطيف الضوئي لـ RNA المستخلص من المصل البشري زيادة في إنتاجية RNA نتيجة إضافة عدة خطوات إلى طريقة Chomsky التقليدية.

يتناقض ملف الأشعة فوق البنفسجية (UV) النموذجي لـ RNA المستخلص من المصل البشري مع الملفات الناتجة عن استخدام خطوات التحسين، بما في ذلك إضافة الجليكوجين وعملية دوران إضافية، حيث أدى الجمع بين هذه الأدوات إلى تقليل الملوثات وزيادة إجمالي عائد RNA. كما زادت نقاء عينة RNA بشكل أكبر باستخدام هلام قفل الطور (phase lock gel)، الذي يعمل على حبس الفينول والبروتينات. بالإضافة إلى ذلك، فإن زيادة حجم المصل لها تأثير ملحوظ على عائد RNA.

تم إجراء تحليل باستخدام جهاز bioanalyzer لمزيد من التحليل لجودة العينة. وتمثل ذروة واحدة عند 21 nucleotide تقريباً جزء micro RNA؛ حيث تم إجراء تحليل المصفوفات (array profiling) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (QPCR) وفقاً للإجراء المتبع. يُظهر ملف المصفوفة هذا لثلاث عينات من سرطان الرأس والرقبة وعينة واحدة طبيعية (S) تعبيراً عن microRNAs، والتي حُللت باستخدام التجميع الهرمي (hierarchical clustering) وعُرضت على شكل خريطة حرارية (heat map) حيث يمكن ملاحظة زيادة التعبير (upregulation) أو نقص التعبير (downregulation) لـ microRNAs.

تم إنشاء منحنيات تضخيم QPCR التالية لـ microRNAs محددة. ثم استُخدمت هذه البيانات لرسم قيم CT الخام للمصل الطبيعي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تطبيقها على أي عدد من المرضى لإنتاج RNA عالي الجودة في أقصى قدر ممكن اليوم إذا تم تنفيذها بشكل صحيح وفقاً للإجراء المتبع. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل PCR الكمي أو تسلسل الجيل القادم للإجابة على أسئلة إضافية مثل اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق من صحتها.