الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التفاعل الديناميكي بين بروتين ربط الحمض النووي وجزيء الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين تقنيتين أحادي الجزيء في مجهر مصمم خصيصا ، والملاقط البصرية المزدوجة والفحص المجهري الفلوري. تم تجهيز هذا الإعداد أيضا بإضاءة المجال الساطع للتصور وتثبيت النانومتر للعينة.

كخطوة ثانية ، تم تصميم خلية تدفق متعددة القنوات مدمجة في نظام التدفق الصغير للسماح لما يصل إلى أربعة تدفقات رقائقية بتوظيف وتجميع جميع المكونات المطلوبة للتجربة بكفاءة. بعد ذلك ، يتم تجميع بنية الجزيء الفردي لإجراء التجارب. يتم التقاط أول كريتين مجهريتين مطليتين بالتيتين الشريطية باستخدام الملقط البصري المزدوج في القناة الأولى.

ثم يتم نقل الخرزتين المحاصرتين إلى القناة الثانية للسماح بربط قالب الحمض النووي المسمى بالبيوتين على كلا الطرفين. يتم التحقق من وجود جزيء DNA واحد في القناة الثالثة عن طريق تحليل امتداد قوة الحمض النووي. أخيرا ، يتم نقل بنية حبة الحمض النووي المسماة دمبل الحمض النووي إلى قناة البروتين حيث يوجد بروتين مثبط اللاكتوز المسمى بالفلورسنت.

تم الحصول على النتائج التي تظهر الانتشار والارتباط المحدد لجزيئات العين LAC المفردة على جزيء DNA واحد ممتد والقياس الكمي للمعلمات الحركية لحركة العين LAC. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على طرق الجزيء الفردي الحالية في إمكانية التحكم في التوتر المطبق على الجزيء الجديد ، وإمكانية تتبع حركات البروتينات المرتبطة بدقة على بقعة مستقرة نانومترية ، بالإضافة إلى القدرة على العمل بعيدا عن سطح النوم الغطاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تفاعلات الحمض النووي للبروتين ، خاصة فيما يتعلق بآليات تنظيم التعبير الجيني ، بالإضافة إلى ديناميكيات انتشار البروتين على طول الحمض النووي في آليات البحث عن الهدف.

يعد هذا العرض التوضيحي لهذه الطريقة مفيدا جدا لإظهار الجوانب العملية لبناء معالجة عينة خلية التدفق وتجميع بناء حبة الحمض النووي الفائق. سيوضح هذا الفيديو أولا كيفية التحقق من ثبات التأشير لجهازي ليزر المحاصرة باستخدام حبات صغيرة عالقة على سطح انزلاق الغطاء كمرجع. يمكن العثور على تفاصيل حول تصميم وبناء إعداد الملقط البصري في نص البروتوكول المصاحب.

استخدم زلة غطاء مقاس 24 × 60 ملم لنشر ميكرولترين من حبات السيليكا على سطح زلة غطاء مقاس 24 × 32 ملم. باستخدام قطعتين من الشريط على الوجهين. قم بتوصيل زلة الغطاء مقاس 24 × 32 ملم على شريحة مجهرية لإنشاء خلية تدفق.

املأ خلية التدفق ب 50 مللي مولار من عازلة الفوسفات وأغلقها بصورة شحم السيليكون. حبة سيليكا واحدة في الفحص المجهري للحقل الساطع عند تكبير 2000 مرة تقريبا. وينبغي أن يكون مجال الرؤية حوالي سبعة × خمسة ميكرومترات مكتسبة عند 7 68 × 5 76 بكسل بحيث يبلغ قطر صورة الخرزة حوالي 190 بكسل تعوض الانجرافات الحرارية باستخدام برنامج التغذية المرتدة الذي يحسب موضع XY من مركز الصورة و Z من حلقات الحيود ويصحح الانجرافات

تحريك مرحلة بيزو بدقة نانومتر أو تداخل أفضل مع مركز المصيدة اليسرى مع مركز الخرزة وقياس ضوضاء الموضع وانحرافها المعياري عن الصمام الثنائي للصور للكاشف الرباعي أو QDP. كرر القياس للمصيدة الصحيحة. يجب أن يكون الانحراف المعياري لضوضاء الموضع في حدود بضعة نانومترات للسماح بالتوطين الدقيق لبروتينات ربط الحمض النووي لصنع خلية التدفق.

يستخدم الطرف الماسي لأول مرة لحفر ثقوب قطرها ملليمتر واحد في مجهر 76 × 76 × مليمتر واحد. قم بالتمرير لإنشاء أربعة مداخل ومخرج واحد. سيسمح ذلك بما يصل إلى أربعة تدفقات عازلة متوازية.

يحتوي كل منها على أحد المكونات المختلفة المطلوبة لخرز التجربة ، والبروتين المسمى بالفلورسنت ومخزن التصوير. قم بتنظيف شريحة المجهر بالإيثانول وتوسيط المنفذ مع إدخال الحلقة O والحلقة اللاصقة في الشريحة المحيطة بفتحات الوصول. من الضروري ارتداء القفازات خلال هذه الخطوة لتجنب بصمات الأصابع التي من شأنها أن تزعج عملية الإلتصاق.

بمساعدة شريحة ثانية ، قم بتثبيت منافذ النانو على الشريحة وضعها في فرن مسخن مسبقا على حرارة 180 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بالتثبيت الكامل. في غضون ذلك ، ارسم نمط المخطط التفصيلي لخلية التدفق على قطعة من الورق. يجب أن يكون عرض القناة حوالي ثلاثة ملليمترات وأن تتطابق مع المواضع بأكملها على شريحة المجهر.

ضع الرسم فوق قطعتين من perfil وباستخدام مشرط ، قم بعمل قطع حادة ومستمرة على طول المخطط المرسوم. قم بإزالة أي نتوءات متكونة ، وتخلص من طبقة العطر السفلية ، والتي تستخدم فقط لضمان دعم نظيف. بعد ذلك ، ضع شريحة المجهر التي تحتوي على منافذ النانو المرفقة رأسا على عقب في الدعامة المعدنية.

قم بمحاذاة مخطط غرفة التشكيل بعناية مع الثقوب ، وتأكد من أن المعلمة لا تقذف مداخل ومخرج غطاء الغرفة مع زلة غطاء مجهر نظيفة وإزالة المعلمات الزائدة المحيطة بالغرفة بعناية. ضع كتلتين حراريتين تم تسخينهما مسبقا عند 120 درجة مئوية فوق خلية التدفق لتطبيق ضغط متجانس عليها. دع الفيلم يذوب لمدة 25 دقيقة تقريبا.

الخطوة التالية هي تحضير خزان الضغط والحاويات العازلة. خزان الضغط مصنوع من زجاج شبكي ويسمح باستيعاب ما يصل إلى ست حاويات عازلة. أولا ، قم بتوصيل صمامات الإغلاق عند مخرج الحاويات العازلة لتشغيل التدفق العازل باستخدام ذراع الصمام في الوضع الرأسي أو إيقاف تشغيله في وضع التدوير في اتجاه عقارب الساعة.

أثناء التجارب ، قم بتركيب خلية التدفق على مرحلة المجهر. ثم قم بتوصيل صمامات الإغلاق من خلال بولي الأثير أو كيتون الأثير أو أنابيب الذروة ، والدوران بدون حواف بمداخل غرفة التدفق. يبلغ قطر أنبوب الذروة حوالي 150 ميكرومتر كيلومترا ، ويستخدم ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات من أنابيب بروبيلين الإيثيلين المفلورة بقطر داخلي يبلغ حوالي 500 ميكرومتر كحلقة وصل بين أنابيب الذروة وتجميعات منفذ النانو لخلية التدفق.

يعد ذلك ضروريا لتقليل التدفق العازل عند مدخل الغرفة لتجنب كسر خلية التدفق أو انفصال منفذ النانو عن الزجاج. من ناحية أخرى ، سيتطلب استخدام الأنابيب ذات القطر الداخلي الكبير وحده كميات كبيرة من العينات البيولوجية. قم بتوصيل مخرج غرفة التدفق بأنبوب فالكون مفتوح عند الضغط الجوي.

يعمل هذا الأنبوب كالتخلص من المخزن المؤقت المتدفق من غرفة التدفق. لبدء هذا الإجراء ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت A إلى كل حاوية من الحاويات العازلة وقم بتطبيق 200 مللي بار من الضغط لغسل أنابيب التوصيل وخلية التدفق. نظام التحكم في الضغط قادر على ذلك.

أخيرا ، ضبط ضغط الهواء داخل خزان الضغط. تحقق من وجود فقاعات هواء ، مما قد يعطل نعومة التدفق. سيساعد النقر اللطيف على أنبوب المخرج على إزالة أي فقاعات متبقية ، وتقليل الضغط إلى 20 ملي بار ، والتحقق من أن جميع القنوات والأنابيب خالية من فقاعات الهواء وأن المخزن المؤقت يتدفق بسرعات مماثلة في جميع القنوات.

تحضير العينات إلى حجم نهائي يبلغ 300 ميكرولتر. تستخدم هذه التجربة حبات البوليسترين المطلية بالستريتر ، والحمض النووي الخطي الحيوي على كلا الطرفين الذي يحتوي على تسلسلات مستهدفة محددة لربط مثبط اللاكتوز وبروتين مثبط اللاكتوز المسمى بالفلورسنت. أضف كل عينة إلى إحدى حاويات الحقن بالترتيب التالي في الحمض النووي للقناة الأولى في الثانية ، والمخزن المؤقت للتصوير في القناة الثالثة والبروتين المسمى في القناة الرابعة.

قم بتشغيل التدفق عند 20 ملي بار وافتح صمامات الإغلاق للسماح للعينات بالوصول داخل قناة التدفق. يمكن اكتشاف ذلك بسهولة في قناة الخرزة. أثناء تصوير القناة الأولى تحت إضاءة المجال الساطع ، قم بتشغيل الملقطين البصريين والتقط حبة البوليسترين في كل مصيدة

انتقل بسرعة إلى القناة الثانية لتجنب سقوط الخرزات الأخرى في الفخاخ. لاحظ أن الوصول إلى قناة الحمض النووي يمكن ملاحظته بسهولة بنهاية تدفق الخرزة. باستخدام عاكس بصري AO واحد أو حركة OD ، تتحرك حبة مصيدة واحدة ذهابا وإيابا بالقرب من الخرزة الأخرى للسماح بربط الحمض النووي الممتد للتدفق بين الخرزتين المحاصرتين بصريا.

عندما يتم تشكيل دمبل الحمض النووي ، تبدأ الخرزة الثابتة في اتباع حركة الخرزة التي يتم تحريكها بنشاط ذهابا وإيابا بواسطة المصيدة انتقل بسرعة إلى قناة المخزن المؤقت وقم بإيقاف تشغيل تدفق المخزن المؤقت. قم بإجراء تحليل منحنى تمديد القوة للتحقق من وجود جزيء DNA واحد.

يتم تحقيق ذلك عن طريق فصل الخرزتين عن بعضهما البعض أثناء قياس توتر الحمض النووي. بمجرد الحصول على دمبل واحد من الحمض النووي ، قم بتشغيل التدفق مرة أخرى وانقل الدمبل إلى قناة البروتين. قم بالتبديل إلى الفحص المجهري الفلوري واسع المجال لمراقبة تفاعل بروتين مثبط اللاكتوز المسمى مع الحمض النووي ، وإيقاف التدفق وبدء الاستحواذ.

تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثبط اللاكتوز الفردي أو جزيئات العين اللاكية التي تتفاعل مع جزيء الحمض النووي الممتد. في هذا التمثيل CH agram ، ينتشر جزيء عين لاك واحد على طول تسلسلات الحمض النووي غير المحددة ، بينما يرتبط جزيء عين لاك آخر على وجه التحديد بعامل واحد يقع في وسط جزيء الحمض النووي. توضح هذه المؤامرة موضع جزيئين من العين اللاكية على طول الاتجاه الذي يربط بين مركزي المصائد.

كدالة للوقت ، تم تحديد مواضع الجزيئات بواسطة خوارزمية مركز التماثل الشعاعي الموضحة هنا وهي مخطط لمتوسط الإزاحة المربعة أو MSD مقابل الوقت لجزيء عين لاك واحد ينتشر على طول جزيء الحمض النووي الممتد. يمكن الحصول على معامل انتشار البروتين بسهولة من الانحدار الخطي للبيانات. يعد الجمع بين تقنيات التلاعب والتصوير طريقة قوية ، مما يسمح بالتحكم الميكانيكي في بوليمر بيولوجي واحد مثل D-N-A-R-N-A أو خيوط الهيكل الخلوي ، والتوطين المتزامن لجزيئات البروتين المفردة التي تتفاعل مع البوليمر نفسه.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الجمع بين تقنيات معالجة الجزيء الفردي والتصوير يتطلب تصميما دقيقا للإعداد التجريبي لضمان استقرار مستوى النانومتر للبوليمر المعلق. على الطرف الآخر ، هناك حاجة إلى تصميم مناسب للمسبار البيولوجي لضمان فصل خاص بين ليزر G المحاصر ومسبار الفلورسنت. يرجى الرجوع إلى نص البروتوكول المصاحب للحصول على التفاصيل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع جزيء الحمض النووي بين النبضين البصريين السريعين لتجميع هذا البناء. من الأفضل الحصول عليها باستخدام خلية التدفق متعددة القنوات التي قدمنا لها الوصف التفصيلي. أشرنا أيضا إلى كيفية تحسين التدفق العازل وإزالة فقاعات الهواء ، والتي قد تضر بتجاربك.

في بروتوكول النص المدمج ، يمكنك العثور على بروتوكولات تسمية الحمض النووي باستخدام bioTE ، وهو أمر ضروري للتجميع باستخدام النبضات المطلية بالستربتافيدين بالإضافة إلى بروتوكولات تصنيف البروتين. أخيرا ، أوضحنا العمليات خطوة بخطوة لتحديد الارتباط وانتشار بروتين مثبط لللاكتوز واحد على جزيء الحمض النووي الممتد.