الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التفاعل الديناميكي بين بروتين واحد رابط للحمض النووي DNA وجزيء DNA. ويتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين تقنيتين للجزيء الواحد في مجهر مصمم خصيصاً، وهما الملاقط الضوئية المزدوجة والمجهر الفلوري. كما تم تجهيز هذا الإعداد بإضاءة المجال المضيء للتصور والتثبيت النانومتري للعينة.

كخطوة ثانية، يتم بناء خلية تدفق متعددة القنوات مدمجة في نظام تدفق ميكروي للسماح بما يصل إلى أربعة تدفقات صفائحية بتجنيد وتجميع كافة المكونات المطلوبة للتجربة بكفاءة. بعد ذلك، يتم تجميع بناء الجزيء المنفرد من أجل إجراء التجارب. أولاً، يتم التقاط كرتين مجهريتين مطليتين ببروتين titin المخطط باستخدام الملاقط الضوئية المزدوجة في القناة الأولى.

يتم بعد ذلك نقل الخرزتين المحجوزتين إلى القناة الثانية للسماح باتصال قالب DNA الموسوم بالبيوتين عند الطرفين. ويتم التحقق من وجود جزيء DNA واحد في القناة الثالثة من خلال تحليل تمدد قوة DNA. وأخيراً، يتم نقل بنية "خرزة-DNA-خرزة" المسماة "دمبل DNA" إلى قناة البروتين حيث يتواجد بروتين كابت اللاكتوز الموسوم فلورياً.

تم الحصول على نتائج تظهر الانتشار والارتباط النوعي لجزيئات LAC eye مفردة على جزيء DNA واحد ممدد، بالإضافة إلى التحديد الكمي للمعاملات الحركية لحركة LAC eye. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق الجزيء الواحد الحالية في إمكانية التحكم في قوة الشد المطبقة على الجزيء الجديد، والقدرة على تتبع حركات البروتينات المرتبطة بدقة فوق بقعة مستقرة بمقياس النانومتر، فضلاً عن القدرة على العمل بعيداً عن سطح شريحة التغطية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية حول تفاعلات البروتين مع DNA، لا سيما فيما يتعلق بميكانيكا تنظيم التعبير الجيني، وكذلك ديناميكيات انتشار البروتين على طول DNA في آليات البحث عن الهدف.

يعتبر هذا العرض التوضيحي لهذه الطريقة مفيداً جداً لإظهار الجوانب العملية لبناء خلية التدفق، ومعالجة العينات، وتجميع بنية خرزات DNA. سيوضح هذا الفيديو أولاً كيفية التحقق من استقرار توجيه ليزري الحصر باستخدام خرزات دقيقة مثبتة على سطح شريحة غطاء كمرجع. يمكن العثور على تفاصيل تصميم وبناء إعداد الملقط البصري في نص البروتوكول المصاحب.

استخدم شريحة غطاء بمقاس 24 × 60 مليمتر لنشر 2 µL من حبيبات السيليكا على سطح شريحة غطاء بمقاس 24 × 32 مليمتر. وباستخدام قطعتين من الشريط اللاصق ذو الوجهين، قم بتثبيت شريحة الغطاء بمقاس 24 × 32 مليمتر على شريحة مجهرية لإنشاء خلية تدفق.

املأ خلية التدفق بـ 50 millimolar من محلول الفوسفات المنظم وأحكم إغلاقها باستخدام شحم السيليكون. خرزة سيليكا واحدة تحت مجهر الحقل المضيء بتكبير يصل إلى 2000 مرة تقريبًا. يجب أن يكون مجال الرؤية حوالي سبعة في خمسة micrometers، ويتم التقاط الصورة بدقة 68×576 بكسل بحيث يكون قطر صورة الخرزة حوالي 190 بكسل. قم بتعويض الانزياحات الحرارية باستخدام برنامج تغذية راجعة يحسب الموقع XY من مركز الصورة والموقع Z من حلقات الحيود ويصحح الانزياحات.

عند تحريك منصة بيزو (pizo stage) بدقة نانومترية أو أفضل، قم بمطابقة مركز المصيدة اليسرى مع مركز الخرزة، ثم قم بقياس ضوضاء الموضع وانحرافها المعياري باستخدام الصمام الثنائي الضوئي لكاشف الربع (quadrant detector photo diode) أو QDP. كرر عملية القياس للمصيدة اليمنى. يجب أن يكون الانحراف المعياري لضوضاء الموضع في حدود بضع نانومترات للسماح بتحديد دقيق لمواقع البروتينات المرتبطة بـ DNA لتصنيع خلية التدفق.

يُستخدم أولاً رأس ماسي لحفر ثقوب بقطر 1 mm في شريحة مجهرية مقاس 76 × 76 × 1 mm، وذلك لإنشاء أربعة مداخل ومخرج واحد. سيتيح ذلك تدفق ما يصل إلى أربعة محاليل منظمة بشكل متوازٍ.

يحتوي كل منها على أحد المكونات المختلفة المطلوبة للتجربة: الخرز، والـ DNA، والبروتين المسمى فلورياً، ومحلول التصوير المنظم. نظف شريحة المجهر باستخدام الإيثانول، وقم بتوسيط المنفذ مع إدخال الحلقة الدائرية (O-ring) والحلقة اللاصقة في الشريحة حول فتحات الوصول. من الضروري ارتداء القفازات خلال هذه الخطوة لتجنب ترك بصمات الأصابع، والتي قد تعيق عملية اللصق.

بمساعدة مشبك شرائح ثانٍ، قم بتثبيت المنافذ النانوية على الشريحة، ثم ضعها في فرن تم تسخينه مسبقاً عند 180 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لضمان الالتصاق التام. وفي هذه الأثناء، ارسم المخطط الخارجي لخلية التدفق على قطعة من الورق؛ بحيث يكون عرض القناة حوالي 3 ملم وتتوافق مع جميع المواضع الموجودة على شريحة المجهر.

ضع الرسم فوق قطعتين من الـ perfil، وباستخدام المشرط، قم بإجراء قطع حادة ومستمرة على طول الخط الخارجي المرسوم. قم بإزالة أي نتوءات تكونت، وتخلص من طبقة الـ parfum السفلية، والتي تُستخدم فقط لضمان وجود دعامة نظيفة. بعد ذلك، ضع شريحة المجهر التي تحتوي على المنافذ النانوية (nano ports) المثبتة مقلوبة في الدعامة المعدنية.

قم بمحاذاة مخطط غرفة البارافيلم بعناية مع الفتحات، مع التأكد من أن البارافيلم لا يبرز خارج مداخل ومخرج غطاء الغرفة باستخدام شريحة غطاء مجهر نظيفة، ثم قم بإزالة البارافيلم الزائد المحيط بالغرفة بعناية. ضع كتلتين حراريتين تم تسخينهما مسبقاً عند 120 درجة Celsius فوق خلية التدفق لتسليط ضغط متجانس عليها. اترك البارافيلم لينصهر لمدة 25 دقيقة تقريباً.

تتمثل الخطوة التالية في تحضير خزان الضغط وحاويات المحلول المنظم. يتكون خزان الضغط من البليكسي جلاس ويسمح باستيعاب ما يصل إلى ست حاويات للمحلول المنظم. أولاً، قم بتوصيل صمامات الإغلاق عند مخرج حاويات المحلول المنظم لتشغيل تدفق المحلول المنظم عندما يكون ذراع الصمام في الوضع العمودي، أو إيقافه عند تدويره في اتجاه عقارب الساعة.

أثناء التجارب، قم بتثبيت خلية التدفق على منصة المجهر. بعد ذلك، قم بتوصيل صمامات الإغلاق عبر أنابيب البولي إيثر إيثر كيتون (PEEK)، وربط الوصلات غير ذات الحواف بمداخل غرفة التدفق. يبلغ القطر الداخلي لأنابيب PEEK حوالي 150 micrometers، ويتم استخدام حوالي ثلاثة سنتيمترات من أنابيب بروبيلين إيثيلين المفلور (FEP) بقطر داخلي يبلغ حوالي 500 micrometers كوصلة بين أنابيب PEK ومجموعات المنافذ النانوية لخلية التدفق.

يُعد هذا الأمر ضرورياً لتقليل تدفق المحلول المنظم عند مدخل الغرفة لتجنب كسر خلية التدفق أو انفصال المنفذ النانوي عن الزجاج. ومن ناحية أخرى، فإن استخدام أنابيب ذات قطر داخلي كبير بمفردها سيتطلب أحجاماً كبيرة من العينات البيولوجية. قم بتوصيل مخرج غرفة التدفق بأنبوب Falcon مفتوح عند الضغط الجوي.

تُستخدم هذه الأنبوبة للتخلص من المنظم المتدفق من غرفة التدفق. لبدء هذا الإجراء، أضف 1 mL من المنظم A إلى كل من حاويات المنظم، ثم طبق ضغطاً قدره 200 mbar لغسل الأنابيب الموصلة وخلية التدفق. يمكن استخدام نظام للتحكم في الضغط لهذا الغرض.

أخيراً، يتم ضبط ضغط الهواء داخل خزان الضغط. يجب التحقق من وجود فقاعات هوائية، والتي قد تعيق سلاسة التدفق. تساعد نقرة خفيفة على أنبوب المخرج في إزالة أي فقاعات متبقية، ثم يتم خفض الضغط إلى 20 millibars، والتحقق من خلو جميع القنوات والأنابيب من الفقاعات الهوائية ومن تدفق المحلول المنظم بسرعات متماثلة في جميع القنوات.

قم بتحضير العينات لتصل إلى حجم نهائي قدره 300 microliters. تستخدم هذه التجربة حبيبات بوليسترين مغلفة بـ strept، وحمض DNA خطي مُبَيوتين (biotinylated) عند كلا الطرفين ويحتوي على تسلسلات مستهدفة محددة لارتباط بروتين كابت اللاكتوز، وبروتين كابت اللاكتوز المسمى فلوريسنتيًا. أضف كل عينة إلى أحد حاويات المحقنة بالترتيب التالي: الحبيبات في القناة الأولى، الـ DNA في القناة الثانية، ومحلول التخزين التصويري (imaging buffer) في القناة الثالثة، والبروتين المسمى في القناة الرابعة.

قم بتشغيل التدفق عند 20 millibars وافتح صمامات الإغلاق للسماح بوصول العينات إلى داخل قناة التدفق. يمكن اكتشاف ذلك بسهولة في قناة الخرز. وأثناء تصوير القناة الأولى تحت إضاءة المجال المضيء (brightfield)، قم بتشغيل الملاقط الضوئية الاثنين والتقط خرزة بوليسترين في كل مصيدة.

انتقل بسرعة إلى القناة الثانية لتجنب سقوط الخرزات الأخرى في المصائد. لاحظ أن الوصول إلى قناة DNA يمكن تمييزه بسهولة من خلال نهاية تدفق الخرزات. باستخدام عاكس بصري AO واحد أو حركة OD، حرك إحدى الخرزات المحاصرة ذهابًا وإيابًا بالقرب من الخرزة الأخرى للسماح بالتصاق DNA الممتد بفعل التدفق بين الخرزتين المحاصرتين بصريًا.

عندما يتشكل دمبل DNA، تبدأ الخرزة الثابتة في تتبع حركة الخرزة التي يتم تحريكها بنشاط ذهاباً وإياباً بواسطة المصيدة. انتقل سريعاً إلى قناة المنظم وأوقف تدفق المنظم. أجرِ تحليلاً لمنحنى تمدد القوة للتحقق من وجود جزيء DNA واحد.

يتم تحقيق ذلك من خلال فصل الخرزتين عن بعضهما البعض مع قياس شد الـ DNA. وبمجرد الحصول على دمبل DNA واحد، قم بتشغيل التدفق مرة أخرى ونقل الدمبل إلى قناة البروتين. انتقل إلى مجهر الفلورسنت ذو المجال الواسع لمراقبة التفاعل بين بروتين كابح اللاكتوز المسمى والـ DNA، ثم أوقف التدفق وابدأ عملية الاستحواذ.

تتيح هذه الطريقة الكشف عن جزيئات مفردة من كابت اللاكتوز أو lac eye التي تتفاعل مع جزيء DNA ممدد. في هذا المخطط التمثيلي، ينتشر جزيء lac eye واحد على طول تسلسلات DNA غير محددة، بينما يرتبط جزيء lac eye آخر بشكل محدد بمشغل واحد يقع في مركز جزيء DNA. يوضح هذا الرسم البياني موضع جزيئي lac eye على طول الاتجاه الذي يربط بين مركزي المصيدتين.

باعتبارها دالة في الزمن، تم تحديد مواقع الجزيئات باستخدام خوارزمية مركز التماثل الشعاعي؛ يظهر هنا رسم بياني لمتوسط مربع الإزاحة أو MSD مقابل الزمن لجزيء lacI واحد ينتشر على طول جزيء DNA ممدد. يمكن الحصول على معامل الانتشار للبروتين بسهولة من خلال الانحدار الخطي للبيانات. إن الجمع بين تقنيات التحكم والتصوير يمثل طريقة قوية، حيث يتيح التحكم الميكانيكي في بوليمر بيولوجي واحد مثل DNA أو RNA أو خيط هيكلي خلوي، مع التحديد المتزامن لمواقع جزيئات بروتينية مفردة تتفاعل مع البوليمر نفسه.

عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الدمج بين تقنيات التلاعب بالجزيء المنفرد والتصوير يتطلب تصميماً دقيقاً للإعداد التجريبي لضمان استقرار البوليمر المعلق على مستوى النانومتر. ومن ناحية أخرى، يلزم التصميم المناسب للمسبار البيولوجي لضمان الفصل الطيفي بين ليزر الاحتجاز G والمسبار الفلوري. يرجى الرجوع إلى نص البروتوكول المصاحب للحصول على التفاصيل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع جزيء DNA بين النبضات الضوئية السريعة. ومن الأفضل الحصول على تجميع هذا البناء باستخدام خلية التدفق متعددة القنوات التي قدمنا وصفاً تفصيلياً لها. كما أوضحنا كيفية تحسين تدفق المنظم وإزالة الفقاعات الهوائية، والتي قد تؤثر بخلاف ذلك على تجاربك.

في بروتوكول النص المدمج، يمكنك العثور على البروتوكولات الخاصة بوسم DNA باستخدام bioTE، وهو أمر ضروري للتجميع مع الحبيبات المغلفة بالستريبتأفيدين (streptavidin)، بالإضافة إلى البروتوكولات الخاصة بوسم البروتين. وأخيراً، أوضحنا العمليات التفصيلية خطوة بخطوة لتقدير كمية الارتباط والانتشار لبروتين كابت للاكتوز مفرد على جزيء DNA ممتد.