تصنيع المركزة، الأوكسجين القائم على الدهون Microbubble المستحلبات بواسطة High القص التجانس والتركيز المسلسل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع كمية كبيرة من فقاعات الأكسجين الدقيقة القائمة على الدهون وذاتية التجميع، أو ما يُعرف بـ OMS، من أجل توصيل الأكسجين عن طريق الوريد. يتم تحقيق ذلك باستخدام جهاز تجانس عالي القص وخزان محكم الغلق لتصنيع وتركيز الـ oms تسلسلياً. تتمثل الخطوة الثانية في استخدام محاقن معدلة لبث مستحلب LOM يحتوي على 70 بالمئة حجمياً من الأكسجين.

بعد ذلك، يتم تركيز المستحلب عن طريق الطرد المركزي للحصول على رغوة أكسجين بنسبة 90% من حيث الحجم. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء مراقبة الجودة من خلال حساب النسبة المئوية الحجمية للأكسجين وتقييم توزيع حجم الجسيمات باستخدام تقنية تشتت الضوء. وفي النهاية، ينتج عن التجانس عالي القص لتران من OMS يحتوي على 90% أكسجين بالحجم.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق التصنيع الحالية مثل الموجات فوق الصوتية والدمج، في أن التجانس ينتج فقاعات دقيقة ذاتية التجمع بمقياس لترات، وهو الحجم الضروري لاختبار توصيل الأكسجين العلاجي في الحيوانات الكبيرة. وأحد استخدامات هذه التقنية هو علاج المرضى الذين يعانون من نقص أكسجة شديد، لأن الفقاعات الدقيقة المملوءة بغاز الأكسجين تنقل الأكسجين إلى الهيموجلوبين المنقوص الأكسجين في غضون ثوانٍ وتكاد تحمل ثلاثة أضعاف محتوى الأكسجين في الدم Visual. ويعد توضيح هذه الطريقة أمراً هاماً بقدر عمق رأس المجانس.

قد يكون من الصعب تقدير الحفاظ على بيئة مؤكسدة تماماً والتمييز بين LMS المركز مقابل الطور المائي. يتكون نظام تصنيع فقاعات الأكسجين الدقيقة القائمة على الدهون أو OMS من خزان حفظ وتركيز أو HCT مجهز بخلاط أحادي المرحلة، ومجانس عالي القص على الخط، ومضخة أسطوانية لنقل السائل بين HCT والمجانس، ومبادل حراري.

لبدء إعداد النظام، ضع وعاء تجميع زجاجيًا معقمًا واسع الفوهة سعة أربعة لترات، مزودًا بمنفذين في القاعدة وثلاثة منافذ جانبية، أسفل الخلاط أحادي المرحلة. قم بتجهيز أحد منافذ القاعدة، المنفذ رقم واحد من منافذ HCT، بأنبوب شفاف معقم بقطر داخلي 3/8 بوصة، وبطول 10 بوصات تقريبًا، ومزود بصنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات عند الطرف لتجميع المستحلب المركز. بعد ذلك، جهز منفذ القاعدة الثاني، المنفذ رقم اثنين، بأنبوب معقم بقطر داخلي 3/8 بوصة، وبطول 36 بوصة تقريبًا. مرر هذا الأنبوب عبر المضخة الأسطوانية.

يتم تركيب قطعة على شكل حرف T عند مدخل المجانس عالي القص تحتوي على منفذين. صِل الأنبوب من المنفذ رقم اثنين عبر المضخة الأسطوانية، ثم صِله بالمنفذ الجانبي لقطعة الـ T. صِل المنفذ الآخر بخزان أكسجين باستخدام مقياس تدفق غاز أكسجين منخفض التدفق.

قم بتوصيل منفذ المخرج في المجانس عالي القص بمنفذ المدخل لمبادل حراري خطي يتم الحفاظ عليه عند درجة حرارة 4 °C. ثم صِل منفذ المخرج للمبادل الحراري بمنفذ العودة في جهاز HCT لإنشاء نظام حلقة مغلقة. قم بتوصيل خزان الأكسجين عبر مقياس تدفق بجهاز HCT من خلال المنفذ رقم أربعة.

أخيراً، قم بتوصيل مراقب لتكوين الغاز يكون مفتوحاً على الغلاف الجوي بالمنفذ العلوي لـ HCT. لبدء هذا الإجراء، ضع 20 جراماً من GMP one two DYS steer oil، أو SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE أو DSPC و10 جرامات من الكوليسترول في قاعدة HCT. أضف لتراً واحداً من plasma light A إلى HCT وقم بالتقليب يدوياً لمدة دقيقة واحدة، لدمج أكبر قدر ممكن من الدهون في الطور المائي.

اخفض الخلاط أحادي المرحلة في الطور المائي، مع التأكد من أن رأس الخلاط بالكامل مغمور في الطور المائي. ولمنع الهواء المحيط من تلويث الحيز العلوي، استخدم سدادات مطاطية أو شريطًا لاصقًا لضمان أن يكون الجزء العلوي من HCT محكم الغلق ضد الغازات وعدم وجود منافذ جانبية مفتوحة. قم بتشغيل مصدر الغاز المتصل بالمنفذ رقم أربعة وانتظر حتى يتجاوز كسر الأكسجين في الحيز العلوي لـ HCT نسبة 95%. باستخدام الخلاط أحادي المرحلة، اخلط مستحلب السلائف لمدة خمس دقائق. وبسرعة 5,000 RPM، يجب أن يظهر الخليط الناتج بلون أبيض باهت وألا يحتوي على أي تكتلات دهنية مرئية.

بمجرد الخلط، يمكن تخزين خليط الدهون والماء غير المستخدم في درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة تصل إلى 30 يومًا قبل الاستخدام الواحد. يتم تحضير نظام الحلقة المغلقة بالكامل عن طريق ملئه بمستحلب السلف عبر تشغيل المضخة الأسطوانية بمعدل 1.3 لتر في الدقيقة أو LPM. وبمجرد تحضير النظام، تُترك المضخة تعمل بمعدل 1.3 LPM لبدء تصنيع الـ LO's.

قم بتشغيل المجانس عالي القص المدمج على سرعة 7, 500 RPM. بعد ذلك مباشرةً، قم بتشغيل تدفق الأكسجين إلى جزء المدخل في المجانس بمعدل 0.5 LPM. حافظ على تشغيل الخلاط أحادي المرحلة في HCT على سرعة 3, 500 RPM.

تتكون الـ Oms عند الواجهة بين شفرات الدوار وشاشات المستحلب داخل المجانس المدمج. وخلال الدقائق القليلة الأولى، يجب أن يصبح السائل أكثر لزوجة بشكل ملحوظ. قم بتشغيل النظام لمدة 15 دقيقة، ثم أوقف تشغيل المجانس عالي القص ومدخل الأكسجين إليه.

يقلل هذا من انفصال الطور ويحافظ على تجانس المنتج نسبيًا داخل HCT. لاحظ أن حجم المستحلب المملوء بالغاز يجب أن يزداد بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف تقريبًا خلال مرحلة التركيز المتسلسل. لقد تم تعديل محاقن lure lock سعة 140 milliliter المخصصة لجمع OMS المصنّع مسبقًا عن طريق سحب 100 milliliters من الهواء داخل المحقنة، ثم قص المكبس والمادة الزائدة من المحقنة فوق علامة 140 milliliter.

قم بتثبيت محقنة معدلة ومعقمة بصنبور الإيقاف المتصل بمنفذ القاعدة رقم واحد في وعاء التجميع، واستخدم ملقطاً مسنناً لخفض المكبس وسحب 100 ملليلتر من السائل، ثم أغلق المحقنة بإحكام بغطائها. كرر هذه العملية حتى يتم سحب جميع السوائل. قم بطرد مركزي للمحاقن بحيث يكون الطرف المغطى موجهاً لأسفل في جهاز طرد مركزي مبرد عند 225 ×g لمدة 10 دقائق. ستظهر ثلاث طبقات من المواد بعد عملية الطرد المركزي؛ قم بتفريغ والتخلص من الطبقة السفلية المكونة من الطور المائي العكر الزائد.

تتميز الطبقة الثانية بلون أبيض ساطع وتحتوي على oms مركزة. انقل الرغوة المركزة إلى حقنة زجاجية غير نفاذة للغاز باستخدام صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات لمنع التلوث بالغازات المحيطة. تخلص من الطبقة النهائية، التي تحتوي على غاز الأكسجين الحر الناتج عن تمزق oms.

يمكن تقييم جودة الرغوة عن طريق حساب تركيز الغاز كما يلي. ستصل الرغوة عالية الجودة إلى تركيز غاز أكبر من أو يساوي 90 بالمئة حجماً، وكإجراء ثانٍ لمراقبة الجودة، يتم قياس حجم الفقاعات الدقيقة عن طريق تشتت الضوء البصري لتحديد ما إذا كان حجم الجسيمات ضمن النطاق المتوقع. تجدر الإشارة إلى أن التغيير في وقت التجانس أو التركيبة قد يؤدي إلى تغيير حجم الفقاعات، لذا يجب إغلاق المحاقن الزجاجية التي تحتوي على oms المركزة بإحكام.

باستخدام وصلة القفل اللولبي (lure lock)، يمكن تخزين المحاقن عند 22 °C، أو 4 °C، أو -20 °C. قد توفر درجات الحرارة الأكثر برودة استقراراً أفضل لفترة الصلاحية. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تصنيع ما يصل إلى 2 L من محلول OMS المركز خلال 90 دقيقة.

كشف الفحص المجهري الضوئي لعينة بحجم 10 µL من الـ OMS عن وجود OMS كروية الشكل بالإضافة إلى كمية نسبية من الحطام الدهني. وعند تقييم العينة نفسها من الـ OMS عن طريق التشتت البصري، بلغ متوسط قطر الجسيمات 2.624 ± 0.332 µm. وكانت نسبة الـ OMS التي يقل قطرها عن 10 µm أكبر من 90%، كما كان التوزيع الحجمي للمجتمع متعدد التشتت.

اعتمدت لزوجة المستحلب بشكل كبير على الكسر الغازي، وبالتالي على تركيز الفقاعات الدقيقة. تم دراسة عينات بحجم 2 مل من مستحلب LOM عند نسب مئوية حجمية للغاز بلغت 60 و70 و90 باستخدام مسح تدفق في الحالة المستقرة بواسطة لوحين متوازيين بقطر 40 مليمتر.

عندما تباين الإجهاد من 0.1 إلى 1000 past gass، أظهرت مادة OMS التي تحتوي على 60% حجمًا من الغاز ملفًا إشعاعيًا مشابهًا لدم الإنسان. تم اختبار محتوى الأكسجين في مادة OMS عن طريق إضافة أحجام متفاوتة من الأكسجين الموجود ضمن 60% حجمًا من مادة OMS إلى حصص من دم بشري منزوع التشبع مع عجز معروف في الأكسجين. وكانت العلاقة بين حجم الأكسجين المضاف ضمن مادة OMS والزيادة الحجمية في محتوى الأكسجين في الدم 1.053 زائد أو ناقص 0.03025.

يشير ذلك إلى أن OMS المختبرة تحتوي على أكسجين بنسبة تقارب 100%، وأظهرت وجود جيوب غازية محبوسة قليلة، ونقلت حمولة الأكسجين الكاملة بفعالية إلى دم الإنسان في المختبر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لإنتاج لترين من LMS في غضون 90 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح وكفء. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر الحفاظ على الفحص البصري لـ OMS المتراكمة وإجراء مراقبة الجودة عند تركيز رغوة LOM. وباتباع إجراء التصنيع هذا، يمكن استخدام OMS للحقن الوريدي على نطاق واسع وتوصيل الغازات العلاجية.