فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التغيرات الديناميكية في بروتين FTSZ أثناء انقسام الخلايا في البكتيريا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تطبيق خلايا خفية من العصيات تعبر عن FTS قال اندماج GFP على سطح وسادة aros صغيرة. ثم يتم قلب الوسادة ونقلها إلى طبق بتري مع غطاء زجاجي قاع انزلاقي.

الخطوة الثانية هي الحصول على صور بفاصل زمني للبكتيريا أثناء انقسام الخلية باستخدام فحص مجهري للإضاءة ثلاثية الأبعاد أو نظام تصوير 3D SIM. بعد ذلك ، يتم تقييم جودة البيانات الأولية والتخلص من الصور التي تزيد عن 30٪ من الانخفاض في الكثافة بسبب التبييض الضوئي. تتمثل الخطوة الأخيرة في التحليل الكمي للتغيرات في توطين البروتين أثناء انقسام الخلية عن طريق قياس توزيع شدة التألق لبروتين F-T-S-Z-G-F-P بمرور الوقت.

في نهاية المطاف ، يتم استخدام بطاقة SIM ثلاثية الأبعاد السريعة لإظهار مدى ديناميكية بروتينات الديون أثناء انقسام الخلايا في البكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، هي أننا نحصل على معلومات ثلاثية الأبعاد حول التغييرات التي تحدث في انقسام الخلايا في خلايا الحياة. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة للحركية الخلوية البكتيرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى حيث نريد النظر إلى التغيرات البروتينية الديناميكية مثل خلايا الثدييات M.

خطرت لنا فكرة ذلك لأول مرة عندما رأينا صور sim ثلاثية الأبعاد التقليدية للخلايا البكتيرية الثابتة أظهرت أن بروتين FDZ لم يتم توزيعه بشكل متجانس حول حلقة zed. أردنا إجراء مزيد من الفحص لمعرفة ما إذا كان هذا التوزيع مرتبطا بالتغيرات التي حدثت أثناء انقباض حلقة Zed. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية بسبب الفشل في مطابقة معامل الانكسار للزيت مع عينتهم ، وهذا سيؤدي إلى صور ذات جودة رديئة.

لتحضير خلايا العصيات الدقيقة للتصوير ، قم بتنمية الخلايا حتى منتصف المرحلة الأسية كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بإرفاق إطار لاصق على شريحة مجهر زجاجي قياسية عن طريق إزالة لوح البوليستر الرقيق أولا. ثم قم بتطبيق السطح اللاصق المكشوف للإطار على سطح شريحة المجهر لإنشاء بئر مربع بشكل فعال أعلى الشريحة ، واترك لوح البوليستر السميك متصلة بالإطار لمنع التصاق انزلاق الغطاء في الخطوات اللاحقة.

بعد ذلك ، قم بإذابة محلول aro في الميكروويف حتى تغلي الماصة 67 ميكرولتر من الأروس المذاب في الإطار اللاصق. ضع على الفور زلة غطاء فوق الأروس لإنشاء سطح مستو واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. قم بإزالة زلة الغطاء لمدة دقيقة إلى دقيقتين أثناء حصاد العينة.

حصاد كمية واحدة من المليلتر من العينة بعد الطرد المركزي عند 8 ، 000 دورة في الدقيقة للثواني التي تصب فيها المادة الطافية ، تعيد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسط الطازج. خذ 2.5 ميكرولتر من العينة المركزة والماصة على وسادة aros المعدة مسبقا. انشر العينة بالتساوي على طول السطح المسطح لوسادة الأروس.

ثم قم بإزالة الإطار اللاصق من شريحة المجهر باستخدام ملاقط دون لمس وسادة aros. انقل وسادة aros من المجهر. انزلق إلى طبق بتري بقطر 35 ملم مع غطاء زجاجي قاع منزلق.

للتصوير عالي الدقة. اقلب وسادة aros بحيث يكون تعليق الخلية ملامسا مع زلة غطاء طبق بتري. في يوم التجربة ، قم بتشغيل نظام التصوير OMX 3D SIM قبل ساعة واحدة على الأقل من التصوير للسماح للنظام والليزر بالاستقرار الكامل.

ثم قم بتشغيل المكونات المختلفة كما هو موضح في بروتوكول النص على محطة عمل وحدة التحكم الرئيسية. افتح برنامج OMX بالنقر فوق الرمز. قم بتعيين مسار الملف لحفظ البيانات في مجلد بيانات مناسب.

بعد ذلك ، ابدأ برنامج العمل اللين. قم بتشغيل أشعة الليزر المطلوبة للتجارب على الشاشة الرئيسية في قسم معلمات الضوء. قم بتنشيط كاميرا FITC من اختيار القناة وتابع التحقق من المعلمات كما هو موضح في بروتوكول النص.

ضع قطرة من الزيت على الجزء العلوي من الهدف. ضع عينة طبق بتري الذي يحتوي على الخلايا المحضرة في مرحلة داخلية وقم بتغطيتها بغطاء التسخين الدائري. اخفض المسرح حتى يلامس الزيت قاع عينة طبق بتري.

اترك الطبق يسخن لمدة 15 دقيقة في المرحلة باستخدام إعداد تعريض منخفض ، ركز على العينة باستخدام عناصر التحكم في مرحلة تحديد المواقع النانوية. ركز لأعلى ولأسفل عبر العينة لتحديد ما إذا كان الضوء ينتشر بالتساوي أعلى وأسفل المستوى البؤري للعينة. ثم استخدم أحجام خطوات 0.5 ميكرون وحدد الجزء العلوي والسفلي من مكدس الصور قبل العودة إلى منتصف العينة في علامة تبويب التجربة ، انقر فوق الزر الحصول على سمك لتعيين سمك الحصول على العينة.

حدد القيمة القصوى للشدة لصورة العينة باستخدام إعدادات التعريض الضوئي الحالي والنسبة المئوية للضوء المنقول. تم العثور على هذه القيمة أسفل نافذة الصورة. للتصوير بفاصل زمني، اضبط التعريض الضوئي والنسبة المئوية للضوء المنقول للحصول على شدة قصوى من 1100 إلى 1400.

فوق الخلفية. بالنسبة للصورة، قم بتنشيط قسم الفاصل الزمني في علامة تبويب التجربة. قم بتعيين معدل الإطارات المطلوب والوقت الإجمالي في ملف البيانات.

أدخل اسم الملف المناسب. انقر فوق الزر تشغيل لبدء الحصول على الصورة في بداية الحصول على الصورة. لاحظ قيمة الحد الأقصى للكثافة للصورة في بداية الحصول على الصورة للإطار الأول من السلسلة الزمنية.

في نهاية الاستحواذ على الإطار الأول ، تحقق من عدم وجود أكثر من 10٪ انخفاض في شدة الإشارة من خلال Zack لهذا الإطار الأول. في نهاية الحصول على السلسلة الزمنية ، افتح ملف الصورة الأولية الناتج بلاحقة DV وتأكد من الانخفاض في أقصى شدة إشارة من بداية السلسلة الزمنية إلى الصورة النهائية. تجاهل أي نقاط زمنية كان فيها أكثر من 30٪ تبييض للصور من قائمة العملية ، وقم بتنشيط نافذة إعادة بناء SI.

استخدم الإعدادات الموجودة مسبقا لجميع المعلمات. قم بتنشيط زر OTF الخاص بالقناة المستخدمة واضبطه على مجموعة عوامل التصفية القياسية. قم بتنشيط زر زوايا KO الخاصة بالقناة المستخدمة واضبطها على مجموعة المرشحات القياسية.

قم بسحب الملف الخام وإفلاته في مساحة ملف الإدخال. انقر فوق افعلها. افحص توزيع FTSZ حول الحلقة Z لإنشاء مخططات شدة ثلاثية الأبعاد.

ثم افتح ملف صورة ثلاثي الأبعاد. لعرض شرائح z الفردية. استخدم أداة عارض مستوى الصوت الموجودة أسفل علامة تبويب قائمة العرض.

لاقتصاص منطقة اهتمام ، أدخل رقم النافذة لهذه الصورة ثلاثية الأبعاد في نافذة الإدخال وأدخل رقم نافذة جديدا وغير مستخدم في نافذة الإخراج. سيصبح زر تحديد المنطقة متاحا لاقتصاص حلقة Z فردية ذات أهمية من مجال الرؤية الأصلي 40 × 40 ميكرون. اضبط المحور المطلوب ودرجة الدوران في علامة تبويب التدوير.

انقر فوق الزر "افعلها". قم بالتمرير عبر مستوى الصوت للحصول على المنظور المطلوب ، الحلقة Z. استخدم أداة مراقب البيانات لضبط أبعاد صف العمود لإنشاء منطقة اهتمام جديدة حول حلقة Z فردية.

انقر فوق منتصف الصورة لوضع منطقة الاهتمام الجديدة هذه. بيانات الصورة النصية عبارة عن جدول يتم إنشاؤه تلقائيا يعرض شدة التألق لكل بكسل داخل منطقة الاهتمام. انقر على الرسم البياني ثلاثي الأبعاد زر لعرض مخطط الكثافة في البداية.

بدلا من ذلك ، يمكن تصدير بيانات الصورة النصية بالنقر فوق الزر حفظ بيانات الجدول. في قائمة الملفات، انسخ بيانات الصورة من الملف النصي المحفوظ إلى جدول بيانات جديد. حدد جميع الخلايا داخل جدول البيانات وأنشئ رسما بيانيا جديدا للسطح ثلاثي الأبعاد.

قم بتنسيق الرسم البياني لرسم مخطط شدة 3D للنشر لبيانات اللقطات المتتابعة. كرر هذه الخطوات على كل نقطة زمنية مختلفة من ملف الصورة ثلاثية الأبعاد. عند تصورها بواسطة الفحص المجهري الفلوري التقليدي واسع المجال ، تظهر الحلقة Z كشريط عرضي واحد من التألق في العصيات الدقيقة.

شدة التألق في جميع أنحاء هذا النطاق موحدة. يقدم نمط التوطين القليل من التبصر في التنظيم الهيكلي وتوزيع البوليمرات المذكورة FTS داخل الحلقة هنا ، يتم فحص نفس الخلايا. باستخدام طريقة FAST 3D sim.

دوران صورة sim ثلاثية الأبعاد حول المحور Z تصور الحلقة Z كهيكل حلقة حقيقي في فضاء ثلاثي الأبعاد. يسمح التحسن في الدقة بتصور التوزيع غير المتجانس ل FTSZ داخل الحلقة. توضح الأمثلة الإضافية لحلقات Bacillus Z التي تم تصورها بواسطة هذه التقنية كيف أن شدة التألق حول الحلقة Z ليست هي نفسها أبدا.

علاوة على ذلك ، لوحظت مناطق ذات كثافة مضان منخفضة جدا أو فجوات. لتحديد هذه الملاحظات ، تم إنشاء مخططات شدة ثلاثية الأبعاد للحلقة Z. تظهر مخططات الشدة أن كمية التألق يمكن أن تختلف حتى أربعة أضعاف في مناطق مختلفة من العصية الحلقة Z الأكثر دقة.

تظهر مخططات الشدة ثلاثية الأبعاد أن الفجوات تقرأ تقريبا مستويات خط الأساس لمضان الخلفية لتحليل التغييرات الديناميكية التي تحدث داخل الحلقة Z. بمرور الوقت ، يتم تنفيذ الفاصل الزمني لشريحة 3D. يوضح هذا الفيلم كيف يتغير FTSZ داخل حلقة Z الدقيقة للعصية باستمرار ويتم قياسه بمخطط شدة يتم إنشاؤه لكل صورة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمو الخلايا البكتيرية وتحضيرها ، وكيفية تصويرها باستخدام 3D Sim ، وكيفية تحليلها للحصول على بيانات كمية ، وأخيرا ، كيفية تقديم صور بجودة العرض التقديمي. من المهم حقا أثناء الحصول على الصور مراقبة صحة خلاياك وأيضا مراقبة مستوى التعبير عن البروتين الفلوري أثناء الاستحواذ بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق لأشخاص آخرين في مجال بيولوجيا الخلايا البكتيرية لاستخدام طرق الفحص المجهري الأخرى فائقة الدقة وتوطين البروتينات البكتيرية الأخرى في الكائنات الحية المختلفة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء أشكال أخرى من الفحص المجهري فائق الدقة مثل الفحص المجهري للتوطين المنشط بالصور لإلقاء نظرة على التغييرات الديناميكية في البروتين المذكور FDS بمرور الوقت.