قياس العمود الفقري قبل المشبكي في الفئران عن طريق تثبيط الظهرية جذر تسجيل المحتملة

يُعد التثبيط قبل التشابكي أحد أقوى آليات التثبيط في النخاع الشوكي. وتلعب التغيرات المرضية في التثبيط قبل التشابكي دوراً هاماً في آليات عدة من أنماط الأمراض؛ على سبيل المثال، الآلام العصبية والالتهابية، بالإضافة إلى المعالجة المركزية غير الطبيعية للألم.

يُعد هذا الأمر هاماً في حالات إصابة النخاع الشوكي واضطرابات الجهاز العص신 المركزي التي تتسم بفرط استثارة حركية. لذا، عند دراسة النماذج الحيوانية لهذه الاضطرابات، فإن معرفة قوة التثبيط قبل المشبكي توفر معلومات قيمة. ونقدم هنا طريقة لتقييم التثبيط قبل المشبكي في نموذج فأر.

يتم التوسط في التثبيط قبل التشابكي داخل الجسم عن طريق إزالة استقطاب النهايات العصبية الأولية، وهو ما يتم تحفيزه بواسطة التشابكات المحورية-المحورية GABAergic على الألياف الحسية قبل التشابكية. ويؤدي نشاط مستقبلات GABAₐ إلى زيادة في موصلية الكلوريد، مما يؤدي بدوره إلى إزالة استقطاب التدفق الأولي بسبب توزيع تركيز الأيونات المحلي. وتعمل إزالة الاستقطاب هذه على منع انتشار جهود الفعل إلى النهايات الطرفية، مما يقلل من قوتها ويؤدي إلى انخفاض تدفق الكالسيوم وتقليل إطلاق الناقل العصبي.

بناءً على ذلك، يمكن تثبيط جهود ما بعد التشابك الاستثارية في العصبونات التي تستثار تشابكياً دون تغيير جهد غشاء ما بعد التشابك وقابلية استثارة تلك العصبونات. ويعطي الجهد المنقول حجمياً لهذا إزالة الاستقطاب الأولية مقياساً مباشراً للتثبيط قبل التشابكي في النخاع الشوكي، ويمكن قياس هذه الجهود من الجذور الظهرية للنخاع الشوكي بعد التحفيز، وتسمى هذه الجهود بجهود الجذر الظهري. إن قياس جهود الجذر الظهري أمر راسخ ومستخدم على نطاق واسع في القطط والجرذان والضفادع، ولكن في الفئران، أجريت التسجيلات حصرياً تقريباً في تحضيرات النخاع الشوكي المعزولة خارج الجسم (ex vivo). ونصف هنا طريقة لتسجيل جهود الجذور هذه في الفئران المخدرة داخل الجسم (in vivo)، مما يسمح بقياس مباشر للتثبيط قبل التشابكي في الكائن الحي السليم.

لتسجيل استجابة المرتبطين بالترددات (DRP) في الفئران داخل الجسم الحي، يلزم توفير المعدات التالية: أدوات تثبيت سكرية قياسية، ومجهر ستيريو، وثلاثة مقابض يدوية لتحديد موضع قطب التحفيز، وقطب التسجيل، وقطب المرجع على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، يلزم إطار لتثبيت الفأر ونظام تدفئة للتحكم في درجة حرارة جسم الفأر أثناء التحفيز والتسجيل بمفردهما أو باستخدام المحفز.

يلزم وجود مضخم قياسي وجهاز لجمع البيانات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. وأثناء تسجيل جهد الاستجابة المباشرة (DRP)، يلزم استخدام أقطاب كهربائية مُصنعة خصيصاً؛ وللقيام بتصنيعها، يتم سحب أنابيب زجاجية تقليدية باستخدام أداة سحب الماصات القياسية.

قم بكسر طرف القطب الكهربائي باستخدام مبرد ماسي لتوسيع فتحة الطرف. قم بتلميع الطرف باستخدام مشعل مختبري قياسي لتنعيمه. قبل البدء في التحضير، قم بتخدير الحيوان عن طريق حقن الكيتامين في التجويف الصفاقي (IP)، ثم ثبت رأس الفأر داخل الإطار التجسيمي.

بعد ذلك، اختبر عمق التخدير عن طريق قرص العضو التناسلي الخارجي (PO) الخلفي للفأر. لا تبدأ التحضير إلا عند عدم ملاحظة أي سحب للعضو التناسلي الخارجي، ويجب التحقق من عمق التخدير بشكل متكرر أثناء الإجراء. يتم إعطاء حقن متكررة من ketamine sine في العضلة رباعية الرؤوس الخلفية.

أطل تخدير الحيوان، وراقب درجة حرارة جسمه باستخدام المسبار الشرجي. ولتحضير العمود الظهري، قم بفتح الجلد على طول الخط الناصف للظهر.

قم بفصل الجلد عن الأنسجة الكامنة تحته لفصل الفقرة عن الأنسجة الضامة المحيطة بها. قم بإجراء شقين على جانبي العمود الفقري وتوسيع الشقوق عن طريق دفع الأنسجة بعيداً باستخدام المشرط. ثم قم بإزالة النتوءات الشوكية للفقرات العجزية باستخدام ملقط عظمي صغير.

البدء من المستويات القطنية، ثم الانتقال إلى مستويات منتصف الصدر لمنع جفاف هذا الجرح الجراحي. ضع قطعاً صغيرة من الشاش حول الجرح وبللها بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9%.

ابدأ بعد ذلك في تحضير الحبل الشوكي بدءاً من المنطقة القطنية. ادفع طرف ملقط العظم بعناية في المسافة الموجودة بين فقرتين متجاورتين. احرص بشكل خاص على تقليل الضغط المطبق على الحبل الشوكي قدر الإمكان.

انتقل إلى المستويات الصدرية وقم بترطيب الحبل الشوكي باستخدام سائل دماغي شوكي اصطناعي. كرر هذه العملية خلال جميع الخطوات اللاحقة. افتح مقياس صلابة السحايا (durometer) بعناية باستخدام إبرة قياس 30 gorge.

بعد ذلك، قم بفك وفصل جذرين متجاورين من نفس الجانب عن العمود الفقري. ثم اقطع الجذور في أبعد نقطة ممكنة باتجاه الطرف. أثناء الإجراء.

تجنب سحب الجذور بشكل مفرط لأن ذلك سيعيق في النهاية التسجيل الناجح لـ DRP. بعد وضع القطب المرجعي بالقرب من النخاع الشوكي، حرك طرف قطب قسم واحد ليكون على مقربة من الطرف القريب لأحد الجذور الظهرية. ثم ضع الجذر الظهري فوق فتحة طرف قطب الشفط.

بعد ذلك، قم بسحب الجذر الظهري إلى داخل القطب الكهربائي عن طريق تطبيق ضغط سلبي قصير عبر حقنة متصلة بالقطب. ثم املأ القطب بـ A CSF مع تطبيق ضغط سلبي مستمر ومنخفض حتى يحيط المحلول بكل من الجذر الظهري وسلك الفضة والكلوريد داخل القطب. بعد ذلك، ارفع طرف القطب الكهربائي عن الحبل الشوكي لضمان عدم وجود جسر سائل يتسبب في حدوث دائرة قصيرة في القطب.

كرر الخطوات للجذر المجاور الثاني في نفس الجانب. بمجرد وضع كلا القطبين الكهربائيين، ابدأ تسجيل جهد الجذر الظهري (DRP) عن طريق تحفيز مسار واحد مع التسجيل من المسار الآخر، مع زيادة جهد التحفيز إلى مستويات فوق القصوى. تبدو التسجيلات النموذجية لجهود الجذر الظهري مثل تلك الموضحة في اللوحة اليسرى.

يتبع أثر تحفيز قصير انحراف إيجابي قصير ثم انحراف سلبي ممتد. يمثل الانحراف الأخير جهد الجذر الظهري الفعلي، ويمكن حساب سعته بالنسبة لخط الأساس المسجل مباشرة قبل تسجيل التحفيز.

قد تتداخل عدة آثار ناتجة عن زوج واحد من الجذور، كشوائب ناشئة عن حركات التنفس أو تداخلات تخطيط كهربائية القلب (EKG)، مع استجابة DRP المسجلة. وبعد إتمام التسجيل بنجاح، يمكن تبديل موقعي التحفيز والتسجيل وإجراء تسجيل ثانٍ. وتتم طريقة التسجيل المعروضة كالتالي.

تتيح قياسات جهد الجذور في الجسم الحي تقييم الاستجابة الأولية، والاستقطاب المضاد، والحيوان السليم، لا سيما عند دمجها مع استخدام الفئران المعدلة وراثياً. ويمكن أن تكون هذه العملية أداة قوية لاستقصاء الآليات الكامنة وراء التثبيط النخاعي. ويعد التكامل النخاعي أمراً حاسماً للوظيفة الحركية والإدراك الحسي متعدد الوسائط.

تُعد هذه الطريقة مفيدة في الأبحاث التي تتناول الألم، وإصابات النخاع الشوكي، وإصابات الأعصاب الطرفية، والالتهابات. يتيح تسجيل DRP في الجسم الحي (in vivo) للمحللين دراسة التفاعلات بين النشاط فوق الشوكي والوسادة. وهذا الأمر غير ممكن في تحضيرات النخاع الشوكي المعزولة التي تُستخدم عادةً لقياس DRP في الفئران.

من حيث المبدأ، يمكن تطبيق الدواء على النخاع الشوكي أثناء التسجيل. وقد يؤدي التطبيق الموضعي عبر ماصات إضافية إلى تحسين وتسريع التحكم في تركيز الدواء الموضعي.